Nakładanie się witryny docelowej
W białku palca cynkowego pewne sekwencje reszt aminokwasowych są w stanie rozpoznać i związać się z rozszerzonym miejscem docelowym składającym się z czterech lub nawet pięciu nukleotydów . Gdy dzieje się tak w ZFP, w którym podmiejsca trzech nukleotydów są ciągłe, jeden palec cynkowy przeszkadza z sąsiadującym z nim miejscem docelowym palca cynkowego, sytuacja znana jako nakładanie się miejsca docelowego . Na przykład palec cynkowy zawierający argininę w pozycji -1 i kwas asparaginowy w pozycji 2 wzdłuż swojej helisy alfa rozpozna rozszerzoną sekwencję czterech nukleotydów o sekwencji 5'-NNG(G/T)-3'. Wiązanie wodorowe między Asp 2 i N4 zasady cytozyny lub adeniny sparowanej odpowiednio z guaniną lub tyminą definiuje te dwa nukleotydy w pozycji 3', definiując sekwencję, która zachodzi na podmiejsce dowolnego palca cynkowego, który może być przyłączony N-końcowo.
Nakładanie się miejsc docelowych ogranicza modułowość tych palców cynkowych, które je wykazują, ograniczając liczbę sytuacji, w których można je zastosować. Jeśli niektóre palce cynkowe są ograniczone w ten sposób, potrzebny jest większy repertuar, aby zająć się sytuacjami, w których nie można ich użyć. Nakładanie się miejsc docelowych może również wpływać na wybór palców cynkowych podczas wyświetlania , w przypadkach, gdy aminokwasy na nierandomizowanym palcu i zasady powiązanej z nim podstrony wpływają na wiązanie reszt na sąsiednim palcu, który zawiera randomizowane reszty. Rzeczywiście, próby wyprowadzenia białek palca cynkowego ukierunkowanych na rodzinę sekwencji 5'-(A/T)NN-3' przez ukierunkowaną mutagenezę drugiego palca białka C7 zakończyły się niepowodzeniem z powodu Asp 2 trzeciego palca wspomnianego białko.
Stopień, w jakim zachodzi nakładanie się miejsc docelowych, jest w dużej mierze nieznany, przy czym różne aminokwasy wykazały udział w takich interakcjach. Podczas interpretacji repertuarów palców cynkowych przedstawionych w badaniach z użyciem prezentacji fagowej ZFP , ważne jest, aby docenić wpływ, jaki reszta szkieletu palca cynkowego mogła mieć w tych selekcjach. Ponieważ wydaje się, że problem występuje tylko w ograniczonej liczbie przypadków, problem ten jest nieważny w większości sytuacji, w których istnieje wiele odpowiednich celów do wyboru i staje się prawdziwym problemem tylko wtedy, gdy wymagane jest wiązanie z określoną sekwencją DNA (np. blokowanie wiązania przez endogenne białka wiążące DNA).
- ^ a b Wolfe SA, Grant RA, Elrod-Erickson M, Pabo CO (2001). „Poza„ kodem rozpoznawczym ”: struktury dwóch kompleksów Cys2His2 palec cynkowy / pudełko TATA” . Struktura . 9 (8): 717–23. doi : 10.1016/S0969-2126(01)00632-3 . PMID 11587646 .
- ^ a b Beerli RR, Barbas CF (2002). „Inżynieria polidaktylowych czynników transkrypcyjnych palca cynkowego”. Nat. Biotechnologia . 20 (2): 135–41. doi : 10.1038/nbt0202-135 . PMID 11821858 . S2CID 12685879 .
- ^ a b c Segal DJ, Dreier B, Beerli RR, Barbas CF (1999). „W kierunku kontrolowania ekspresji genów do woli: selekcja i projektowanie domen palca cynkowego rozpoznających każdą z docelowych sekwencji DNA 5'-GNN-3'” . proc. Natl. Acad. nauka USA . 96 (6): 2758–63. Bibcode : 1999PNAS...96.2758S . doi : 10.1073/pnas.96.6.2758 . PMC 15842 . PMID 10077584 .
- ^ Dreier B, Fuller RP, Segal DJ i in. (2005). „Opracowanie domen palca cynkowego do rozpoznawania sekwencji DNA rodziny 5'-CNN-3' i ich zastosowanie w konstrukcji sztucznych czynników transkrypcyjnych” . J. Biol. chemia . 280 (42): 35588–97. doi : 10.1074/jbc.M506654200 . PMID 16107335 .