Chimera palca cynkowego

Chimera białka palca cynkowego to chimeryczne białka składające się z domeny białka palca cynkowego wiążącej DNA i innej domeny, przez którą białko wywiera swoje działanie. Domeną efektorową może być aktywator transkrypcji (A) lub represor (R), domena metylacyjna (M) lub nukleaza ( N).

Modyfikacja endogennej domeny palca cynkowego wiążącej DNA jest podstawą najbardziej zaawansowanej dziedziny w konstruowaniu specyficznych dla genów sztucznych czynników transkrypcyjnych . Połączenie ze sobą sześciu ZFP daje miejsce docelowe o wielkości 18-19 pz. Zakładając specyficzność dla tej jednej sekwencji i że sekwencja genomu jest przypadkowa, 18 pz jest wystarczająco długie, aby być unikalnym we wszystkich znanych genomach. Rzeczywiście, odstępy między podmiejscami stają się częścią sekwencji docelowej z powodu ograniczeń elastyczności białka, które można kontrolować. Celowanie w miejsca tak małe jak 9 pz zapewnia pewien stopień specyficzności, prawie na pewno związany w jakiejś części z okluzją chromatyny.

Produkcja domeny białkowej palca cynkowego

W zależności od wymagań badania, dostępnych jest kilka technik definiowania domeny rozpoznawania DNA, która nada specyficzność czynnikowi transkrypcyjnemu opartemu na ZFP. Opisano trzy strategie prezentacji fagowej , obejmujące równoległą, sekwencyjną lub dwudzielną selekcję składowych palców cynkowych.

Wybór równoległy

Podejście doboru równoległego (ryc. 1 (A)) zakłada, że poszczególne domeny palca cynkowego są funkcjonalnie niezależne. Na tej podstawie istniejące z góry określone domeny powinny nadawać się do użytku bez dodatkowego projektowania lub wyboru, dzięki czemu jest to szybka i dostępna technika dla każdego laboratorium. Nie jest to prawdą w każdym przypadku, tak że ta strategia jest narażona na problemy związane z nakładaniem się miejsca docelowego w wielu sekwencjach docelowych, jak omówiono później. Jeśli to konieczne, możliwe może być przezwyciężenie problemu nakładania się miejsc docelowych przez losowanie reszt aminokwasowych na granicy dwóch palców cynkowych, na których występuje.

Wybór sekwencyjny

Selekcja sekwencyjna (ryc. 1 (B)), zaproponowana przez grupę Pabo w 1997 r., obejmuje kooperatywne wiązanie między palcami cynkowymi w celu wytworzenia domen wiążących DNA o dużym powinowactwie i swoistości. Jak sugeruje nazwa, każdy palec jest wybierany z losowej biblioteki w kontekście wcześniej wybranego palca. Techniki stosowane w selekcji są podobne do opisanych poniżej, z wyjątkiem tego, że docelowy oligonukleotyd stosowany w selekcji zawiera całą sekwencję docelową. Jak pokazano na ryc. 1, tworzona jest biblioteka, w której trzeci palec zawiera losową helisę alfa. Wybrano domenę o najlepszych właściwościach wiązania, a następnie włączono ją do innej biblioteki, w której usunięto kotwicę pierwszego palca i dodano kolejny losowy palec na przeciwległym końcu. To trwa i skutkuje domeną wiążącą DNA, w której wszystkie palce zostały wybrane w kontekście sąsiedniego palca, a ponieważ każda runda selekcji jest stosowana do tej samej końcowej sekwencji docelowej, nadal występuje nakładanie się miejsc docelowych, ale jest to zaleta, a nie zaleta przeszkoda.

Główną wadą tego podejścia jest konieczność tworzenia oddzielnej biblioteki dla każdego palca cynkowego, co przekracza możliwości większości laboratoriów.

Wybór dwustronny

Metoda selekcji dwudzielnej (ryc. 1 (C)) została zaproponowana przez Isalan i in., 2001 jako kompromis między strategiami selekcji równoległej i sekwencyjnej. Pierwsze i ostatnie 5 pz z docelowego miejsca o 9 pz wybiera się równolegle i łączy w celu wytworzenia biblioteki, z której wybiera się ostateczny ZFP.

Aby utrzymać rozmiar biblioteki w rozsądnych granicach, technika ta jest ograniczona do randomizacji tylko kluczowych reszt biorących udział w rozpoznawaniu zasad. Ponadto, w przeciwieństwie do selekcji równoległej, ta technika wymaga wielu panoram, zanim będzie można skonstruować nowy ZFP.

Selekcja palca cynkowego przez prezentację fagową

W celu określenia najbardziej odpowiedniej sekwencji aminokwasów w helisie alfa palca cynkowego do wiązania się z daną sekwencją DNA, można zastosować technikę obejmującą prezentację fagową. Zmieniając genom wybranego bakteriofaga, możliwe jest stworzenie faga, który będzie prezentował ZFP jako część swojego płaszcza białkowego. Taki fag można następnie przetestować pod kątem przylegania, za pomocą dołączonych palców cynkowych, do oligonukleotydu zawierającego sekwencję będącą przedmiotem zainteresowania, podczas gdy inny, nieprzylegający fag jest wypłukiwany. DNA w fagu koduje eksprymowane ZFP, więc ekstrakcja i sekwencjonowanie DNA związanego faga dostarcza informacji o odpowiednich konfiguracjach aminokwasów do wiązania określonej sekwencji. Stanowi to podstawę do badania wiązania ZFP przez prezentację fagową.

Prace są zwykle wykonywane przy użyciu mysiego ZFP-TF Zif268 lub jednej z jego pochodnych, jako podstawy modyfikacji sekwencji palca cynkowego, ponieważ jest to najlepiej scharakteryzowane ze wszystkich białek palca cynkowego. Jego pochodne C7 lub C7.GAT są często stosowane ze względu na ich doskonałe powinowactwo wiązania i specyficzność. C7.GAT został użyty do zbadania rodzin sekwencji 5'-ANN-3' i 5'-CNN-3', ponieważ trzeci palec C7 definiuje guaninę lub tyminę w pozycji 5' sekwencji drugiego palca (cel nakładanie się witryn). Nitkowaty fag pomocniczy a DNA z faga lambda wykorzystuje się w prezentacji fagowej. Ze względu na ograniczenia wielkości bibliotek, które można rutynowo konstruować, randomizacja może być ograniczona do najbardziej wpływowych aminokwasów w sekwencji ZFP, jak wywnioskowano z krystalografii rentgenowskiej . W badaniu opublikowanym przez Wu i in. glin. (1995), jednak inne badanie przeprowadzone przez Segala i in. (1999) sugeruje znaczenie wszystkich pozycji od -2 do 6 ze względu na niespecyficzne powinowactwo niektórych aminokwasów i zdolność innych do stabilizowania sąsiednich oddziaływań.

Selekcja in vitro palców cynkowych

Jako cel stosuje się krótkie (~34 nt) DNA typu spinki do włosów zawierające miejsce wiązania ZFP ze zmianami występującymi w jednym podmiejscu. Stosowany oligonukleotyd można zsyntetyzować tak, aby zawierał pierwszorzędową grupę n-heksyloaminową na swoim końcu 5', później wykorzystany do przyłączenia albuminy surowicy bydlęcej (BSA). W tym przypadku koniugat stosuje się do wstępnego opłaszczenia studzienki do mikromiareczkowania przed nałożeniem ~1013 ^jednostek faga tworzących kolonie. Po inkubacji faga usuwa się i płytkę przemywa buforem zawierającym 0,5% Tween 20 w celu usunięcia nieprzylegającego faga. Używając kwaśnego buforu do elucji, przylegające fagi usuwa się i neutralizuje zasadą Tris . Dalsze rundy panningu są zakończone, aby zapewnić wzbogacenie próbki, poprzez infekowanie komórek bakteryjnych wymytym fagiem i fagiem pomocniczym, a następnie zebranie wytworzonego faga [wyświetlającego ZFP] do następnej rundy panningu. Jako alternatywę dla BSA, docelowy DNA spinki do włosów może być biotynylowany , a następnie ekstrahowany przy użyciu kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną (streptawidyna tworzy bardzo silne wiązania z biotyną).

Aby zwiększyć specyficzność wybranego faga, zwłaszcza gdy badane są większe biblioteki, stosuje się oligonukleotydy współzawodniczące do sekwestracji tych białek palca cynkowego o mniejszej specyficzności przed dodaniem biotynylowanego docelowego oligonukleotydu. Na przykład DNA plemników ze ścinanego śledzia zwiąże faga z niespecyficzną przyczepnością do DNA. Kolejne rundy panoramowania obejmują zwiększanie stężeń specyficznie syntetyzowanych oligonukleotydów niedocelowych, gdzie wszystkie z wyjątkiem sekwencji podmiejsca docelowego pozostają takie same, aż do pojedynczej różnicy nukleotydów. W szczególności sekwencja docelowa oryginalnego ZFP, który został poddany mutagenezie, jest stosowana w dużych ilościach do selekcji przeciwko „fagowi rodzicielskiemu” zanieczyszczającemu bibliotekę. Wiązanie kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną może być blokowane przez blotto i faga wyświetlającego przeciwciała (nieistotne), tak że wiązanie występuje tylko z cząsteczkami o tak wysokim powinowactwie jak biotyna. Niespecyficzne fagi są usuwane jak poprzednio, przy użyciu buforu zawierającego rozcieńczony Tween 20. Związane fagi są zbierane za pomocą kulek magnetycznych i mogą być eluowane przez inkubację z trypsyna . W ten sposób wybrane zostaną tylko fagi wykazujące wysoce specyficzne ZFP.

Po elucji faga można wysiać na płytkę i wyekstrahować DNA z poszczególnych jednostek tworzących łysinki, poddać restrykcji i wyekstrahować fragmenty o odpowiedniej wielkości po rozdzieleniu metodą PAGE. DNA można następnie zsekwencjonować, aby odkryć pierwotną strukturę białka, która zapewnia przyleganie do sekwencji docelowej. Ten proces jest powtarzany dla każdej z badanych podstron 5'-NNN-3' pojedynczego palca.

Zaprojektowane macierze palców cynkowych

Generowanie macierzy zmodyfikowanych palców cynkowych Cys ₂ His ₂ jest najbardziej rozwiniętą metodą tworzenia białek zdolnych do celowania w pożądane sekwencje genomowego DNA. Większość zaprojektowanych macierzy palca cynkowego jest oparta na domenie palca cynkowego mysiego czynnika transkrypcyjnego Zif268, chociaż niektóre grupy stosowały macierze palca cynkowego oparte na ludzkim czynniku transkrypcyjnym SP1. Zif268 ma trzy indywidualne motywy palca cynkowego, które wspólnie wiążą sekwencję 9 pz z wysokim powinowactwem. Struktura tego białka związanego z DNA została rozwiązana w 1991 roku i stała się bodźcem do wielu badań nad zmodyfikowanymi macierzami palców cynkowych. W latach 1994 i 1995 korzystano z kilku grup pokaz fagowy zmienić specyficzność pojedynczego palca cynkowego Zif268. Carlos F. Barbas i in. zgłosiła również rozwój technologii palca cynkowego w literaturze patentowej i uzyskała szereg patentów, które były ważne dla komercyjnego rozwoju technologii palca cynkowego. Typowe zaprojektowane układy palców cynkowych mają od 3 do 6 pojedynczych motywów palców cynkowych i wiążą miejsca docelowe o długości od 9 do 18 par zasad. Macierze z 6 motywami palca cynkowego są szczególnie atrakcyjne, ponieważ wiążą miejsce docelowe, które jest wystarczająco długie, aby mieć duże szanse na unikalność w genomie ssaka. Istnieją dwie główne metody stosowane obecnie do generowania zaprojektowanych matryc palców cynkowych, montażu modułowego i systemu selekcji bakterii, i toczy się debata na temat tego, która metoda najlepiej nadaje się do większości zastosowań.

Montaż modułowy

Najprostszą metodą generowania nowych układów palców cynkowych jest łączenie mniejszych „modułów” palców cynkowych o znanej specyficzności. Struktura białka palca cynkowego Zif268 związanego z DNA opisana przez Pavleticha i Pabo w ich publikacji z 1991 roku była kluczem do większości tej pracy i opisuje koncepcję uzyskiwania palców dla każdej z 64 możliwych trójek par zasad, a następnie mieszania i dopasowywania tych palcami, aby zaprojektować białka o dowolnej pożądanej specyficzności sekwencji. Najbardziej powszechny proces składania modułowego obejmuje łączenie oddzielnych palców cynkowych, z których każdy może rozpoznać sekwencję DNA o 3 parach zasad, w celu wygenerowania macierzy 3-palcowych, 4-, 5- lub 6-palcowych, które rozpoznają miejsca docelowe o długości od 9 par zasad do 18 par zasad . Inna metoda wykorzystuje moduły 2-palcowe do generowania tablic palców cynkowych zawierających do sześciu pojedynczych palców cynkowych. Wykorzystano Laboratorium Barbas Instytutu Badawczego Scripps prezentacja fagowa w celu opracowania i scharakteryzowania domen palca cynkowego, które rozpoznają większość sekwencji trypletów DNA, podczas gdy inna grupa wyizolowała i scharakteryzowała poszczególne palce z ludzkiego genomu. Potencjalną wadą montażu modułowego jest to, że specyfika poszczególnych palców cynkowych może się nakładać i może zależeć od kontekstu otaczających palców cynkowych i DNA. Niedawne badanie wykazało, że duża część 3-palcowych macierzy palców cynkowych generowanych przez modułowy montaż nie wiąże zamierzonego celu z wystarczającym powinowactwem w bakteryjnym teście dwuhybrydowym i nie działa jako nukleazy palca cynkowego , ale wskaźnik sukcesu był nieco wyższy, gdy celem były witryny w postaci GNNGNNGNN. W kolejnym badaniu wykorzystano montaż modułowy do generowania nukleaz palca cynkowego zarówno z macierzami 3-palcowymi, jak i 4-palcowymi, i zaobserwowano znacznie wyższy wskaźnik sukcesu w przypadku macierzy 4-palcowych. Zgłoszono również wariant składania modułowego, który uwzględnia kontekst sąsiednich palców, a ta metoda ma tendencję do uzyskiwania białek o ulepszonej wydajności w porównaniu ze standardowym składaniem modułowym.

Metody selekcji

Liczne metody selekcji zostały wykorzystane do wygenerowania macierzy palca cynkowego, które mogą być ukierunkowane na pożądane sekwencje. Początkowe próby selekcji wykorzystywały prezentację na fagach aby wybrać białka, które wiążą dany cel DNA z dużej puli częściowo losowych macierzy palców cynkowych. Ta technika jest trudna do zastosowania na więcej niż jednym palcu cynkowym naraz, dlatego opracowano wieloetapowy proces, który wygenerował całkowicie zoptymalizowaną macierz 3-palcową poprzez dodanie i optymalizację pojedynczego palca cynkowego na raz. Nowsze wysiłki wykorzystywały drożdżowe systemy jednohybrydowe, bakteryjne systemy jedno- i dwuhybrydowe oraz komórki ssaków. Obiecująca nowa metoda selekcji nowatorskich 3-palcowych układów palców cynkowych wykorzystuje bakteryjny system dwuhybrydowy i została nazwana przez jej twórców „OPEN”. Ten system łączy wstępnie wybrane pule poszczególnych palców cynkowych, z których każdy został wybrany do wiązania danej trójki, a następnie wykorzystuje drugą rundę selekcji w celu uzyskania 3-palcowych macierzy zdolnych do wiązania pożądanej sekwencji 9 pz. System ten został opracowany przez Konsorcjum Zinc Finger jako alternatywa dla komercyjnych źródeł opracowanych matryc palców cynkowych. Nieco trudno jest bezpośrednio porównać właściwości wiązania białek wytworzonych tą metodą z białkami wytworzonymi przez składanie modułowe, ponieważ profile specyficzności białek wytworzonych metodą OPEN nigdy nie zostały opisane.

Aplikacje

Zaprojektowane macierze palców cynkowych można następnie wykorzystać w wielu zastosowaniach, takich jak sztuczne czynniki transkrypcyjne, metylazy palca cynkowego, rekombinazy palca cynkowego i nukleazy palca cynkowego . Chociaż wstępne badania z inną domeną wiążącą DNA z bakteryjnych efektorów TAL są obiecujące, dopiero okaże się, czy domeny te nadają się do niektórych lub wszystkich zastosowań, w których obecnie stosowane są inżynieryjne palce cynkowe. Sztuczne czynniki transkrypcyjne z zaprojektowanymi macierzami palców cynkowych zostały wykorzystane w wielu badaniach naukowych, a sztuczny czynnik transkrypcyjny, który aktywuje ekspresję VEGF jest obecnie oceniany u ludzi jako potencjalne leczenie kilku wskazań klinicznych. Nukleazy palca cynkowego stały się użytecznymi odczynnikami do manipulowania genomami wielu organizmów wyższych, w tym Drosophila melanogaster , Caenorhabditis elegans , tytoniu , kukurydzy , danio pręgowanego , różnych typów komórek ssaków i szczurów . Trwające badanie kliniczne ocenia nukleazy palca cynkowego , które zakłócają gen CCR5 w ludzkich komórkach T CD4+ jako potencjalne leczenie HIV/AIDS .

Badanie właściwości wiążących

Badania te wymagają użycia rozpuszczalnych ZFP, ponieważ przyłączenie do faga może zmienić charakterystykę wiązania palców cynkowych. Po wybraniu ZFP, jego sekwencję subklonuje się z pComb3H do zmodyfikowanego bakteryjnego wektora ekspresyjnego, pMal-c2, łącząc go z sekwencją kodującą białko wiążące maltozę . Rekombinant jest następnie transformowany do komórek XL1-Blue i indukowana jest ekspresja przez dodanie izopropylo-β-D-tiogalaktozydu (IPTG). Zamrożone/rozmrożone ekstrakty można następnie oczyścić do wykorzystania w kolejnych doświadczeniach. Chociaż oczyszczanie nie jest konieczne w przypadku wielotarczowego testu ELISA, jest ono niezbędne do pomiaru powinowactwa wiązania za pomocą rezonansu plazmonowego i śladów DNazy. Można to przeprowadzić przy użyciu kolumny Heparin-Sepharose FPLC zrównoważonej buforem cynkowym, a następnie potwierdzić jednorodność za pomocą densytometrii żelowej SDS PAGE.

Badanie specyficzności

Specyficzność ZFP wyselekcjonowanych przez prezentację fagową jest testowana przy użyciu wielotarczowego testu immunoenzymatycznego (ELISA). ZFP nanosi się na studzienki do mikromiareczkowania pokryte streptawidyną i biotynylowanym docelowym oligonukleotydem. Po inkubacji studzienki przemywa się w celu usunięcia palców cynkowych, jeśli nie przylegają one do docelowej sekwencji, po czym nanosi się mysie przeciwciało anty-MBP ( białko wiążące maltozę ) i inkubuje. Kozie przeciwciało antymysie sprzężone z fosfatazą alkaliczną dodaje się i pozostawia do związania, a następnie przemywa w celu usunięcia przeciwciała, jeśli nie jest ono związane z palcami cynkowymi. Dodaje się substrat fosfatazy alkalicznej i po zatrzymaniu reakcji określa się gęstość optyczną przy 405 nm (OD405) za pomocą spektrofotometrii

Odczyt ze spektrofotometru jest zależny od ilości fosfatazy alkalicznej obecnej w studzience, która z kolei jest proporcjonalna do wiązania danego ZFP. Jeśli ZFP wiąże się z sekwencją, dla której nie został wybrany ze zbyt dużym powinowactwem, nie jest wystarczająco specyficzny dla większości celów medycznych i najprawdopodobniej zostanie odrzucony.

Testy te są powtarzane przy użyciu różnych docelowych oligonukleotydów. Na przykład, badając sekwencje wiążące palce cynkowe 5'-XNN-3', należy zbadać wszystkie 16 możliwych sekwencji oligonukleotydowych. Ponadto, w celu zbadania swoistości wobec 5' nukleotydu, pełnego dopełnienia czterech 5'-ANN-3', 5'-CNN-3', 5'-GNN-3'. Rodziny 5'-TNN-3' stosuje się jako cele w czterech oddzielnych reakcjach i porównuje się względne wiązanie w każdej z nich

Analiza kinetyczna

Analiza kinetyczna dostarcza informacji dotyczących zarówno powinowactwa, jak i swoistości przylegania palca cynkowego do celu. Można to przeprowadzić przy użyciu dostępnego w handlu sprzętu wykorzystującego powierzchniowy rezonans plazmonowy . Powierzchnia chipa czujnika jest pokryta oczyszczoną metodą powinowactwa streptawidyną przed nałożeniem biotynylowanych oligonukleotydów, które również przylegają do powierzchni. Szybkość asocjacji (k _on ) oblicza się mierząc szybkość wiązania ZFP z powierzchnią przy użyciu kilku różnych stężeń białka, podczas gdy szybkość dysocjacji ( k _off ) można obliczyć, zwiększając szybkość przepływu po skojarzeniu. Matematyka jest wykonywana przez oprogramowanie dostarczone z instrumentem.

Alternatywnie, Kd _można obliczyć z testu przesunięcia ruchliwości w żelu , w którym to samo oczyszczone białko inkubuje się z seryjnymi rozcieńczeniami docelowego oligonukleotydu oczyszczonego na żelu, znakowanego końcem 32P. Reakcje inkubacji są następnie rozdzielane przez krótki czas na żelu poliakryloamidowym i oznaczane ilościowo przy użyciu dostępnego w handlu imagera i oprogramowania. Kd oblicza się za pomocą _analizy Scatcharda stosując równanie izotermy wiązania; θb = [peptyd]/([peptyd] + _Kd₎ .

Analiza śladu DNazy I

Aby określić miejsce zajmowane przez ZFP po związaniu z jego docelowym DNA, fragment docelowego genu jest amplifikowany przez PCR i mieszany z fragmentem promotora znakowanym końcem 32P. Ta reakcja jest następnie inkubowana z kilkoma różnymi stężeniami wytworzonego ZFP i oczyszczona przy użyciu jednej z wcześniej opisanych metod nadekspresji (np. pMal-c2 i XL1-Blue) i oczyszczania. Trawienie DNazą I da fragmenty o różnej długości, ale tam, gdzie pozwolono ZFP związać się w wysokim stężeniu, odpowiadające długości fragmentów nie będą obecne w mieszaninie, ponieważ aktywność DNazy została zablokowana przez ZFP w tych miejscach. Próbki rozdziela się na żelu akryloamidowym (~6%), mocznikowym (8 M), stosuje do naświetlania płytek do obrazowania fosforowego i rejestruje za pomocą dostępnej w handlu maszyny do obrazowania fosforowego. Analiza oprogramowania może być również wykorzystana do stworzenia K _d wartości

Nakładanie się witryny docelowej

Pewne sekwencje reszt aminokwasowych są w stanie rozpoznać i są specyficzne dla rozszerzonego miejsca docelowego składającego się z czterech lub nawet pięciu nukleotydów. Kiedy dzieje się tak w ZFP, w którym podmiejsca trzech nukleotydów są ciągłe, jeden palec cynkowy interferuje z miejscem docelowym sąsiadującego z nim palca cynkowego, sytuacja znana jako nakładanie się miejsca docelowego.

Czynniki transkrypcyjne białek palca cynkowego

ZFP-TF, składające się z aktywatorów i represorów, są czynnikami transkrypcyjnymi składającymi się z domeny białka palca cynkowego i dowolnej z wielu domen efektorowych czynnika transkrypcyjnego, które wywierają swoje działanie modulujące wokół dowolnej sekwencji, z którą wiąże się domena ZFP.

Nukleazy palca cynkowego

Nukleazy palca cynkowego obejmują domenę nukleazy, taką jak FokI , zdolną do wprowadzania pęknięć dwuniciowych w locus dowolnej sekwencji, z którą wiąże się domena białka palca cynkowego.

Zobacz też