Nukleaza palca cynkowego

Nukleazy palca cynkowego ( ZFN ) to sztuczne enzymy restrykcyjne generowane przez fuzję domeny wiążącej DNA palca cynkowego z domeną rozszczepiającą DNA . Domeny palca cynkowego można zaprojektować tak, aby celowały w określone pożądane DNA , co umożliwia nukleazom palca cynkowego celowanie w unikalne sekwencje w złożonych genomach . Wykorzystując endogenną maszynerię naprawy DNA, odczynniki te można wykorzystać do precyzyjnej zmiany genomów organizmów wyższych. Obok CRISPR/Cas9 i TALEN , ZFN jest czołowym narzędziem w dziedzinie edycji genomu .

Domeny

Domena wiążąca DNA

Domeny wiążące DNA poszczególnych ZFN zazwyczaj zawierają od trzech do sześciu pojedynczych powtórzeń palca cynkowego i każda może rozpoznać od 9 do 18 par zasad. Jeśli domeny palca cynkowego doskonale rozpoznają sekwencję DNA o 3 parach zasad, mogą wygenerować macierz 3 palców, która może rozpoznać miejsce docelowe o 9 parach zasad. Inne procedury mogą wykorzystywać moduły 1-palcowe lub 2-palcowe do generowania macierzy palców cynkowych z sześcioma lub więcej pojedynczymi palcami cynkowymi. Główną wadą tej procedury jest to, że specyfika poszczególnych palców cynkowych może się nakładać i może zależeć od kontekstu otaczających palców cynkowych i DNA. Bez metod uwzględniających tę „zależność od kontekstu” standardowa procedura montażu modułowego często zawodzi.

Liczne metody selekcji zostały wykorzystane do wygenerowania macierzy palców cynkowych zdolnych do ukierunkowania na pożądane sekwencje. Początkowe próby selekcji wykorzystywały prezentację na fagach aby wybrać białka, które wiążą dany cel DNA z dużej puli częściowo losowych macierzy palców cynkowych. Nowsze wysiłki wykorzystywały drożdżowe systemy jedno- i dwuhybrydowe, bakteryjne systemy jedno- i dwuhybrydowe oraz komórki ssaków. Obiecująca nowa metoda selekcji nowatorskich macierzy palców cynkowych wykorzystuje bakteryjny system dwuhybrydowy i została nazwana przez jej twórców „OPEN”. Ten system łączy wstępnie wybrane pule poszczególnych palców cynkowych, z których każdy został wybrany do wiązania danej trójki, a następnie wykorzystuje drugą rundę selekcji w celu uzyskania 3-palcowych macierzy zdolnych do wiązania pożądanej sekwencji 9 pz. System ten został opracowany przez Konsorcjum Zinc-Finger jako alternatywa dla komercyjnych źródeł zaprojektowanych matryc palców cynkowych.

(patrz: Chimera palca cynkowego, aby uzyskać więcej informacji na temat technik selekcji palca cynkowego)

Domena rozszczepiająca DNA

Pokazano parę ZFN, każdy z trzema palcami cynkowymi wiążącymi się z docelowym DNA, wprowadzając dwuniciową przerwę w domenie FokI, przedstawioną na żółto. Następnie pokazano pęknięcie podwójnej nici jako naprawiane przez naprawę ukierunkowaną na homologię lub niehomologiczne łączenie końców .

Niespecyficzna domena rozszczepiająca z endonukleazy restrykcyjnej FokI typu II jest zwykle stosowana jako domena rozszczepiająca w ZFN. Ta domena rozszczepiająca musi dimeryzować, aby rozszczepić DNA, a zatem para ZFN jest wymagana do namierzenia niepalindromowych miejsc DNA. Standardowe ZFN łączą domenę cięcia z C-końcem każdej domeny palca cynkowego. Aby dwie domeny cięcia mogły dimeryzować i rozszczepiać DNA, dwa indywidualne ZFN muszą wiązać przeciwne nici DNA z ich C-końcami w pewnej odległości od siebie. Najczęściej stosowane sekwencje łącznikowe między domeną palca cynkowego a domeną cięcia wymagają, aby krawędź 5' każdego miejsca wiązania była oddzielona o 5 do 7 bp.

Zastosowano kilka różnych technik inżynierii białek , aby poprawić zarówno aktywność, jak i specyficzność domeny nukleazy stosowanej w ZFN. Ukierunkowana ewolucja została wykorzystana do wygenerowania wariantu FokI o zwiększonej aktywności cięcia, który autorzy nazwali „Sharkey”. Zastosowano również projektowanie oparte na strukturze, aby poprawić specyficzność rozszczepienia FokI poprzez modyfikację interfejsu dimeryzacji, tak aby aktywne były tylko zamierzone gatunki heterodimeryczne.

Aplikacje

palca cynkowego są przydatne do manipulowania genomami wielu roślin i zwierząt, w tym Arabidopsis , tytoniu , soi , kukurydzy , Drosophila melanogaster, C. elegans , Platynereis dumerilii , jeżowca , jedwabnika , danio pręgowanego, żab , myszy , szczurów , królików , świń , bydło i różne rodzaje komórek ssaków. Nukleazy palca cynkowego były również stosowane w mysim modelu hemofilii , a badanie kliniczne wykazało, że ludzkie komórki T CD4 + z genem CCR5 rozerwanym przez nukleazy palca cynkowego są bezpieczne jako potencjalne leczenie HIV / AIDS . ZFN są również wykorzystywane do tworzenia nowej generacji modeli chorób genetycznych zwanych izogenicznymi modelami chorób człowieka .

Wyłączenie allelu

ZFN można wykorzystać do wyłączenia mutacji dominujących u osobników heterozygotycznych poprzez wytworzenie pęknięć dwuniciowych (DSB) w DNA (patrz Rekombinacja genetyczna ) w zmutowanym allelu, które przy braku homologicznej matrycy zostaną naprawione przez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ). NHEJ naprawia DSB, łącząc ze sobą dwa końce i zwykle nie powoduje mutacji, pod warunkiem, że cięcie jest czyste i nieskomplikowane. Jednak w niektórych przypadkach naprawa jest niedoskonała, co powoduje usunięcie lub wstawienie par zasad, powodując przesunięcie ramki i zapobieganie produkcji szkodliwego białka. Można również użyć wielu par ZFN do całkowitego usunięcia całych dużych segmentów sekwencji genomowej. Aby monitorować aktywność edycyjną, PCR obszaru docelowego amplifikuje oba allele, a jeśli jeden zawiera insercję, delecję lub mutację, skutkuje to heterodupleksowym jednoniciowym bąbelkiem, który testy rozszczepiania mogą łatwo wykryć. ZFN były również używane do modyfikowania alleli powodujących choroby w zaburzeniach powtórzeń trojaczków. Rozszerzone ciągi powtórzeń CAG/CTG są genetyczną podstawą kilkunastu dziedzicznych zaburzeń neurologicznych, w tym choroby Huntingtona, dystrofii miotonicznej i kilku ataksji rdzeniowo-móżdżkowych. W komórkach ludzkich wykazano, że ZFN mogą kierować pęknięcia dwuniciowe (DSB) do powtórzeń CAG i zmniejszać powtórzenia z długich patologicznych długości do krótkich, mniej toksycznych długości.

Niedawno grupa naukowców z powodzeniem zastosowała technologię ZFN do genetycznej modyfikacji genu pigmentu gol i genu ntl w zarodku danio pręgowanego. Specyficzne motywy palca cynkowego zostały opracowane w celu rozpoznawania różnych sekwencji DNA. MRNA kodujący ZFN wstrzyknięto do zarodków jednokomórkowych i wysoki odsetek zwierząt nosił pożądane mutacje i fenotypy. Ich prace badawcze wykazały, że ZFN mogą specyficznie i wydajnie tworzyć dziedziczne zmutowane allele w interesujących loci w linii zarodkowej, a allele indukowane przez ZFN mogą być rozmnażane w kolejnych pokoleniach.

Podobne badania wykorzystania ZFN do tworzenia określonych mutacji w zarodku danio pręgowanego zostały przeprowadzone również przez inne grupy badawcze. Gen kdr u danio pręgowanego koduje receptor czynnika wzrostu śródbłonka naczyń-2. Zmiany mutagenne w tym miejscu docelowym zostały wywołane techniką ZFN przez grupę badaczy z USA. Zasugerowali, że technika ZFN umożliwia proste generowanie ukierunkowanej serii alleli mutantów; nie opiera się na istnieniu specyficznych gatunkowo linii embrionalnych komórek macierzystych i ma zastosowanie do innych kręgowców, zwłaszcza tych, których zarodki są łatwo dostępne; wreszcie, możliwe jest również osiągnięcie ukierunkowanego knock-in u danio pręgowanego, dlatego możliwe jest stworzenie modeli chorób ludzkich, które są dotychczas niedostępne.

Edycja alleli

ZFN są również używane do przepisania sekwencji allelu poprzez wywołanie mechanizmu rekombinacji homologicznej (HR) w celu naprawy DSB przy użyciu dostarczonego fragmentu DNA jako matrycy. Mechanizm HR wyszukuje homologię między uszkodzonym chromosomem a fragmentem poza chromosomem i kopiuje sekwencję fragmentu między dwoma uszkodzonymi końcami chromosomu, niezależnie od tego, czy fragment zawiera oryginalną sekwencję. Jeśli osobnik jest homozygotą pod względem docelowego allelu, skuteczność techniki jest zmniejszona, ponieważ nieuszkodzona kopia allelu może służyć jako matryca do naprawy zamiast dostarczonego fragmentu.

Terapia genowa

Powodzenie terapii genowej zależy od skutecznej insercji terapeutycznych genów w odpowiednim docelowym miejscu chromosomalnym w ludzkim genomie , bez powodowania uszkodzenia komórek, mutacji onkogennych lub odpowiedzi immunologicznej . Konstrukcja wektorów plazmidowych jest prosta i jednoznaczna. Specjalnie zaprojektowane ZFN, które łączą niespecyficzną domenę cięcia (N) Fok I endonukleaza z białkami palca cynkowego (ZFP) oferuje ogólny sposób dostarczania specyficznego dla miejsca DSB do genomu i stymulowania lokalnej rekombinacji homologicznej o kilka rzędów wielkości. To sprawia, że ​​ukierunkowana korekcja genów lub edycja genomu jest realną opcją w ludzkich komórkach. Ponieważ plazmidy kodujące ZFN można stosować do przejściowej ekspresji ZFN w celu nakierowania DSB na określone locus genu w komórkach ludzkich, oferują one doskonały sposób ukierunkowanego dostarczania genów terapeutycznych do wcześniej wybranego miejsca chromosomalnego. Podejście oparte na plazmidzie kodującym ZFN może potencjalnie obejść wszystkie problemy związane z wirusowym dostarczaniem genów terapeutycznych. Prawdopodobnie będą to pierwsze zastosowania terapeutyczne ZFN ex vivo z wykorzystaniem własnych komórek macierzystych pacjenta. Po edycji genomu komórek macierzystych komórki można było namnażać w hodowli i ponownie wprowadzać do organizmu pacjenta w celu wytworzenia zróżnicowanych komórek o poprawionych funkcjach. Początkowe cele prawdopodobnie obejmują przyczyny chorób monogenowych, takie jak gen IL2Rγ i gen β-globiny do korekcji genów oraz gen CCR5 do mutagenezy i niepełnosprawności.

Potencjalne problemy

Rozszczepienie poza celem

Jeśli domeny palca cynkowego nie są wystarczająco specyficzne dla ich miejsca docelowego lub nie są ukierunkowane na unikalne miejsce w genomie będącym przedmiotem zainteresowania, może wystąpić cięcie poza celem. Takie rozszczepianie poza celem może prowadzić do wytworzenia wystarczającej liczby pęknięć dwuniciowych, aby przeciążyć maszynerię naprawczą, aw konsekwencji spowodować przegrupowania chromosomów i / lub śmierć komórki. Zdarzenia cięcia poza celem mogą również promować losową integrację DNA dawcy. Wykazano, że dwie oddzielne metody zmniejszają rozszczepianie poza celem dla 3-palcowych ZFN, które celują w dwa sąsiednie miejsca z 9 parami zasad. Inne grupy używają ZFN z 4, 5 lub 6 palcami cynkowymi, które celują w dłuższe i prawdopodobnie rzadsze miejsca, a takie ZFN mogą teoretycznie dawać mniejszą aktywność poza celem. Porównanie pary 3-palcowych ZFN i pary 4-palcowych ZFN wykryło cięcie poza celem w komórkach ludzkich w 31 loci dla 3-palcowych ZFN i w 9 loci dla 4-palcowych ZFN. Sekwencjonowanie całego genomu C. elegans zmodyfikowany parą 5-palcowych ZFN znalazł tylko zamierzoną modyfikację i delecję w miejscu „niezwiązanym z miejscem ZFN”, co wskazuje, że ta para ZFN była zdolna do kierowania na unikalne miejsce w genomie C. elegans .

Immunogenność

Dalsze informacje: Adaptacyjna odpowiedź immunologiczna

Podobnie jak w przypadku wielu obcych białek wprowadzonych do organizmu ludzkiego, istnieje ryzyko odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko czynnikowi leczniczemu i komórkom, w których jest on aktywny. Ponieważ jednak białko musi ulegać ekspresji tylko przejściowo, czas, w którym może rozwinąć się odpowiedź, jest krótki.

Liu i in. odpowiednio ukierunkowanie ZFNickaz na endogenne locus kazeiny b (CSN2) stymuluje dodanie lizostafiny i ludzkiego genu lizozymu przez naprawę ukierunkowaną na homologię i uzyskanie wydzielania krów lizostafiny.

Horyzont

Zdolność do precyzyjnego manipulowania genomami roślin i zwierząt ma liczne zastosowania w badaniach podstawowych, rolnictwie i leczeniu ludzi. Używanie ZFN do modyfikowania genów endogennych było tradycyjnie trudnym zadaniem, głównie ze względu na wyzwanie związane z generowaniem domen palca cynkowego, które celują w pożądaną sekwencję z wystarczającą specyficznością. Udoskonalone metody inżynierii domen palców cynkowych i dostępność ZFN od komercyjnego dostawcy sprawiają, że technologia ta znajduje się w rękach coraz większej liczby badaczy. Kilka grup opracowuje również inne rodzaje zmodyfikowanych nukleaz, w tym zmodyfikowane endonukleazy naprowadzające i nukleazy oparte na zmodyfikowanych Efektory TAL . Nukleazy efektorowe TAL (TALEN) są szczególnie interesujące, ponieważ efektory TAL wydają się być bardzo proste w inżynierii, a TALEN można wykorzystać do celowania w endogenne loci w komórkach ludzkich. Ale do tej pory nikt nie zgłosił izolacji klonalnych linii komórkowych lub organizmów transgenicznych przy użyciu takich odczynników. Jeden rodzaj ZFN, znany jako SB-728-T, został przetestowany pod kątem potencjalnego zastosowania w leczeniu HIV.

Nickazy z palcem cynkowym

Nikazy palca cynkowego (ZFNickazy) są tworzone przez inaktywację aktywności katalitycznej jednego monomeru ZFN w dimerze ZFN wymaganym do rozszczepienia dwuniciowego. ZFNickazy wykazują specyficzną dla nici aktywność nacinania in vitro , a tym samym zapewniają wysoce specyficzne pęknięcia pojedynczej nici w DNA. Te SSB podlegają tym samym mechanizmom komórkowym dla DNA, które wykorzystują ZFN, ale wykazują znacznie zmniejszoną częstotliwość mutagennych napraw NHEJ w docelowym miejscu nacięcia. Ta redukcja zapewnia odchylenie dla modyfikacji genów, w których pośredniczy HR. ZFNickazy mogą indukować ukierunkowane HR w hodowanych komórkach ludzkich i zwierzęcych, chociaż na niższych poziomach niż odpowiadające im ZFN, z których pochodzą, ponieważ nacięcia można naprawić bez zmian genetycznych. Głównym ograniczeniem modyfikacji genów, w których pośredniczy ZFN, jest konkurencja między szlakami naprawy NHEJ i HR. Niezależnie od obecności konstruktu dawcy DNA, oba mechanizmy naprawy mogą być aktywowane po DSB indukowanych przez ZFN. Tak więc ZFNickases jest pierwszą wiarygodną próbą opracowania metody faworyzującej metodę naprawy DNA HR w przeciwieństwie do podatnej na błędy naprawy NHEJ. Ograniczając naprawy NHEJ, ZFNickases może w ten sposób zmniejszyć spektrum niepożądanych zmian poza celem. Łatwość, z jaką ZFNickazy można wyprowadzić z ZFN, zapewnia doskonałą platformę do dalszych badań dotyczących optymalizacji ZFNickaz i możliwego zwiększenia ich poziomu docelowego HR przy jednoczesnym utrzymaniu zmniejszonej częstotliwości NHEJ.

Zobacz też

Dalsza lektura

Linki zewnętrzne

Pobrano z „ https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Zinc_finger_nuclease&oldid=1134410314 ”