Izogeniczne modele chorób człowieka

Modele izogenicznych chorób człowieka to rodzina komórek, które są wybierane lub modyfikowane w celu dokładnego modelowania genetyki określonej populacji pacjentów in vitro . Są wyposażone w genetycznie dopasowaną „normalną komórkę”, aby zapewnić system izogeniczny do badań biologii chorób i nowych środków terapeutycznych. Można ich użyć do modelowania dowolnej choroby o podłożu genetycznym. Rak jest jedną z takich chorób, dla których szeroko stosowano izogeniczne modele chorób ludzkich.

Modele historyczne

Modele chorób izogenicznych człowieka zostały porównane do „pacjentów w probówce”, ponieważ uwzględniają najnowsze badania nad ludzkimi chorobami genetycznymi i czynią to bez trudności i ograniczeń związanych z wykorzystaniem modeli innych niż ludzkie.

W przeszłości komórki uzyskane od zwierząt, zazwyczaj myszy, były wykorzystywane do modelowania szlaków związanych z rakiem. Istnieją jednak oczywiste ograniczenia nieodłącznie związane z wykorzystywaniem zwierząt do modelowania chorób uwarunkowanych genetycznie u ludzi. Pomimo dużego odsetka ochrony genetycznej między ludźmi i myszami, istnieją znaczne różnice między biologią myszy i ludzi, które są ważne dla badań nad rakiem. Na przykład duże różnice w telomerów umożliwiają mysim komórkom ominięcie wymogu telomerazy regulacja w górę, która jest etapem ograniczającym tempo powstawania raka u ludzi. Jako inny przykład, pewne interakcje ligand-receptor są niezgodne między myszami a ludźmi. Ponadto eksperymenty wykazały ważne i znaczące różnice w zdolności do transformacji komórek w porównaniu z komórkami pochodzenia mysiego. Z tych powodów nadal niezbędne jest opracowanie modeli raka wykorzystujących komórki ludzkie.

Kierowanie wektorów

Izogeniczne linie komórkowe są tworzone w procesie zwanym celowaniem w geny homologiczne. Wektory ukierunkowujące, które wykorzystują rekombinację homologiczną, są narzędziami lub technikami stosowanymi do wbijania lub wybijania pożądanej mutacji powodującej chorobę lub SNP ( polimorfizm pojedynczego nukleotydu ), który ma być badany. Chociaż mutacje chorobowe można zbierać bezpośrednio od pacjentów z rakiem, komórki te zwykle zawierają wiele mutacji tła oprócz specyficznej mutacji będącej przedmiotem zainteresowania i zwykle nie uzyskuje się dopasowanej normalnej linii komórkowej. Następnie wektory celujące są używane do „ wbijania ” lub „ wybijania”. ' mutacje genów umożliwiające zmianę w obu kierunkach; od genotypu normalnego do nowotworowego; lub odwrotnie; w scharakteryzowanych liniach ludzkich komórek nowotworowych, takich jak HCT116 lub Nalm6.

Istnieje kilka technologii kierowania genów stosowanych do inżynierii pożądanej mutacji, z których najbardziej rozpowszechnione są pokrótce opisane, w tym kluczowe zalety i ograniczenia, w poniższej tabeli podsumowującej.

Technika Wbicie genu Nokaut genu
rAAV (rekombinowane wektory wirusów związanych z adenowirusami) Ukierunkowane insercje lub modyfikacje są tworzone w obrębie genów endogennych; i tak podlegają:
  1. Prawidłowe mechanizmy regulacji genów; I
  2. Dokładnie odzwierciedlaj zdarzenia chorobowe stwierdzone u prawdziwych pacjentów.

rAAV może wprowadzać subtelne mutacje punktowe, SNP, jak również małe insercje z dużą wydajnością. Co więcej, wiele recenzowanych badań wykazało, że rAAV nie wprowadza żadnych mylących zdarzeń genomowych niezgodnych z celem. [ potrzebne źródło ]

Wydaje się, że jest to preferowana metoda stosowana w środowisku akademickim, biotechnologicznym i farmaceutycznym na podstawie stosunku precyzji do czasu i kosztów. [ potrzebne źródło ] |

Nokauty genów występują w endogennym locus, a zatem są definitywne, stabilne i istotne dla pacjenta. Żadne zakłócające efekty poza celem nie są wywoływane w innych loci genomowych. Wymaga dwuetapowego procesu:
  1. Wygeneruj heterozygotyczną KO
  2. Wygeneruj bi-alleliczny nokaut, celując w drugi allel.

Proces ten może zatem generować 3 genotypy (+/+; -/+ i -/-); umożliwiając zatem analizę funkcji genów haplo-niewystarczających.

Obecnym ograniczeniem jest konieczność sekwencyjnego celowania w pojedyncze allele, co sprawia, że ​​generowanie linii komórkowych z nokautem jest procesem dwuetapowym.|
Rekombinacja homologiczna oparta na plazmidzie Wstawienie odbywa się w miejscu endogennym i ma wszystkie powyższe zalety, ale jest bardzo nieefektywne. Wymaga to również strategii selekcji leków bez promotora, obejmującej generowanie konstruktów na zamówienie. Za pomocą tej metody wygenerowano duży historyczny bank linii komórkowych, który od połowy lat 90. został wyparty przez inne metody. Delecja zachodzi w miejscu endogennym i ma wszystkie powyższe zalety, ale jest nieefektywna. Wymaga to również strategii selekcji leków bez promotora, która obejmuje generowanie konstruktów na zamówienie
Wsuwane Jest to wydajna technika, która umożliwia ukierunkowaną insercję „ektopowych” transgenów w pojedynczym, wcześniej zdefiniowanym locus genomowym (integracja przez miejsce rekombinazy FLP ). To nie jest technika modyfikowania endogennego locus. Transgeny będą zwykle pod kontrolą egzogennego promotora lub częściowo zdefiniowanej jednostki promotora w nieprawidłowej lokalizacji genomowej. Ich ekspresja nie będzie zatem podlegać tej samej regulacji genomicznej i epigenetycznej, co loci endogenne, co ogranicza użyteczność tych systemów do badania funkcji genów. Są jednak dobre do wywoływania szybkiej i stabilnej egzogennej ekspresji genów. Nie dotyczy
Nukleazy palca cynkowego (ZFN) Donoszono, że ZFN osiągają wysokie wskaźniki genetycznych nokautów w docelowym genie endogennym. Jeśli ZFN są dostarczane razem z konstruktem transgenu homologicznym do genu docelowego, można również uzyskać genetyczne knock-in lub insercje. Jedną potencjalną wadą jest to, że wszelkie pęknięcia podwójnej nici poza celem mogą prowadzić do przypadkowych insercji genów poza celem, delecji i szerszej niestabilności genomu; myląc wynikowy genotyp. Jednak nie zaobserwowano mierzalnego wzrostu szybkości losowej integracji plazmidu w ludzkich komórkach wydajnie edytowanych za pomocą ZFN, które celują w złożone miejsce rozpoznawania 24 bp ZFN to ukierunkowane sekwencyjnie endonukleazy, które umożliwiają szybkie i wysoce wydajne (do 90% w populacji komórek masowych) rozerwanie obu alleli genu docelowego, chociaż nie zgłoszono zmian związanych z utratą funkcji zdefiniowanych przez użytkownika lub istotnych dla pacjenta podobne częstotliwości. Poważnym problemem są delecje lub insercje poza celem w innym miejscu genomu. Zaletą szybkości uzyskiwania biallelicznego KO w jednym etapie jest również częściowo złagodzona, jeśli nadal trzeba wyprowadzić klonalną linię komórkową do badania funkcji genów w jednorodnej populacji komórek.
meganukleazy Meganukleazy są funkcjonalnie analogiczne do ZFN. Istnieją ograniczenia związane z ich użyciem, takie jak projekt wektora meganukleazy, który może zająć do 9 miesięcy i kosztować dziesiątki tysięcy dolarów. [ potrzebne źródło ] To sprawia, że ​​meganukleazy są bardziej atrakcyjne w zastosowaniach o dużej wartości, takich jak terapia genowa, agrobiotechnologia i inżynieria linii bioprodukcyjnych.

Rekombinacja homologiczna w modelach chorób komórek nowotworowych

Rekombinacja homologiczna (HR) to rodzaj rekombinacji genetycznej, w której sekwencje genetyczne są wymieniane między dwoma podobnymi segmentami DNA. HR odgrywa główną rolę w podziale komórek eukariotycznych, promując różnorodność genetyczną poprzez wymianę między odpowiednimi segmentami DNA w celu stworzenia nowych i potencjalnie korzystnych kombinacji genów.

HR pełni drugą istotną rolę w naprawie DNA, umożliwiając naprawę pęknięć dwuniciowych w DNA, co jest częstym zjawiskiem podczas cyklu życiowego komórki. To właśnie ten proces jest sztucznie uruchamiany przez powyższe technologie i ładowany w celu wywołania „knock-in” lub „knockout” w określonych genach5, 7.

Niedawny kluczowy postęp odkryto przy użyciu wektorów rekombinacyjnych homologicznych do AAV, które zwiększają niskie naturalne wskaźniki HR w zróżnicowanych komórkach ludzkich w połączeniu z sekwencjami wektorów ukierunkowanych na geny.

Komercjalizacja

Czynniki prowadzące do niedawnej komercjalizacji modeli chorób izogenicznych ludzkich komórek nowotworowych dla przemysłu farmaceutycznego i laboratoriów badawczych są dwojakie.

Po pierwsze, pomyślne opatentowanie technologii ulepszonego wektora ukierunkowanego dostarczyło podstaw do komercjalizacji modeli komórek, które powstały w wyniku zastosowania tych technologii.

Po drugie, tendencja stosunkowo niskich wskaźników sukcesu w farmaceutycznych RnD i ogromne koszty stworzyły realną potrzebę nowych narzędzi badawczych, które nielegalnie określają, w jaki sposób podgrupy pacjentów będą reagować pozytywnie lub będą oporne na ukierunkowane terapie przeciwnowotworowe w oparciu o ich indywidualny profil genetyczny.

Istnieje kilka firm, które pracują nad zaspokojeniem tej potrzeby, poniżej znajduje się lista kluczowych graczy i ich oferta technologiczna.

Zobacz też

Aktualności

Źródła

Pobrano z „ https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Isogenic_human_disease_models&oldid=1096760826 ”