Nukleaza efektorowa podobna do aktywatora transkrypcji

Spacefill rysunek dimerycznej fuzji TALE-FokI (niebieski: TALE; zielony: FokI) związany z DNA (), autorstwa Davida Goodsella

Nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji ( TALEN ) to enzymy restrykcyjne , które można modyfikować w celu cięcia określonych sekwencji DNA. Powstają poprzez fuzję domeny wiążącej DNA TAL z domeną cięcia DNA ( nukleaza , która przecina nici DNA). Efektory podobne do aktywatorów transkrypcji (TALE) można zaprojektować tak, aby wiązały się z praktycznie dowolną pożądaną sekwencją DNA, więc w połączeniu z nukleazą DNA można ciąć w określonych miejscach. Enzymy restrykcyjne można wprowadzać do komórek, do stosowania w edycji genów lub do edycja genomu in situ , technika znana jako edycja genomu za pomocą zmodyfikowanych nukleaz . Obok nukleaz palca cynkowego i CRISPR/Cas9 , TALEN jest czołowym narzędziem w dziedzinie edycji genomu .

Domena wiążąca DNA TALE

Efektory TAL to białka wydzielane przez bakterie Xanthomonas poprzez system wydzielniczy typu III podczas infekowania roślin . Domena wiążąca DNA zawiera powtórzoną, wysoce konserwatywną sekwencję 33–34 aminokwasów z rozbieżnymi 12. i 13. aminokwasem. Te dwie pozycje, określane jako Repeat Variable Diresidue (RVD), są wysoce zmienne i wykazują silną korelację z rozpoznawaniem specyficznych nukleotydów . Ta prosta zależność między sekwencją aminokwasów a rozpoznawaniem DNA umożliwiła inżynierię specyficznych domen wiążących DNA poprzez wybranie kombinacji powtórzeń segmentów zawierających odpowiednie RVD. Warto zauważyć, że niewielkie zmiany w RVD i włączenie „niekonwencjonalnych” sekwencji RVD mogą poprawić specyficzność celowania.

Domena cięcia DNA

Niespecyficzna domena cięcia DNA z końca endonukleazy FokI może być wykorzystana do konstruowania nukleaz hybrydowych które są aktywne w teście na drożdżach. Odczynniki te są również aktywne w komórkach roślinnych i komórkach zwierzęcych. Wstępne badania TALEN wykorzystywały domenę cięcia FokI typu dzikiego, ale niektóre późniejsze badania TALEN wykorzystywały również warianty domeny cięcia FokI z mutacjami zaprojektowanymi w celu poprawy specyficzności cięcia i aktywności cięcia. Domena FokI działa jako dimer, wymagający dwóch konstruktów z unikalnymi domenami wiążącymi DNA dla miejsc w docelowym genomie z odpowiednią orientacją i odstępami. Zarówno liczba reszt aminokwasowych między domeną wiążącą DNA TALE i domeną cięcia FokI, jak i liczba zasad między dwoma poszczególnymi miejscami wiążącymi TALEN wydają się być ważnymi parametrami dla osiągnięcia wysokich poziomów aktywności.

Konstrukcje inżynieryjne TALEN

Prosty związek między sekwencją aminokwasową a rozpoznawaniem DNA domeny wiążącej TALE pozwala na wydajną inżynierię białek. W tym przypadku sztuczna synteza genów jest problematyczna z powodu niewłaściwego wyżarzania powtarzalnej sekwencji znajdującej się w domenie wiążącej TALE. Jednym z rozwiązań tego problemu jest użycie publicznie dostępnego oprogramowania (DNAWorks) do obliczenia oligonukleotydów odpowiednich do złożenia w dwuetapowym PCR składanie oligonukleotydów, a następnie amplifikacja całego genu. Zgłoszono również szereg modułowych schematów składania do generowania zaprojektowanych konstrukcji TALE. Obie metody oferują systematyczne podejście do inżynierii domen wiążących DNA, które jest koncepcyjnie podobne do modułowej metody składania do generowania domen rozpoznawania DNA palca cynkowego .

Przebieg pracy nad edycją genomu Twojego ulubionego genu (YFG) przy użyciu TALEN. Sekwencja docelowa jest identyfikowana, odpowiednia sekwencja TALEN jest konstruowana i wstawiana do plazmidu. Plazmid jest wstawiany do komórki docelowej, gdzie ulega translacji w celu wytworzenia funkcjonalnego TALEN, który wchodzi do jądra i wiąże się oraz rozszczepia sekwencję docelową. W zależności od zastosowania, można to wykorzystać do wprowadzenia błędu (wyeliminowania docelowego genu) lub do wprowadzenia nowej sekwencji DNA do docelowego genu.

Transfekcja

Po złożeniu konstruktów TALEN są one wstawiane do plazmidów ; komórki docelowe są następnie transfekowane plazmidami, a produkty genów ulegają ekspresji i wchodzą do jądra, aby uzyskać dostęp do genomu. Alternatywnie, konstrukty TALEN mogą być dostarczane do komórek jako mRNA, co eliminuje możliwość integracji genomowej białka eksprymującego TALEN. Użycie wektora mRNA może również radykalnie zwiększyć poziom naprawy ukierunkowanej na homologię (HDR) i powodzenie introgresji podczas edycji genów.

Edycja genomu

Mechanizmy

TALEN można wykorzystać do edycji genomów poprzez indukowanie pęknięć dwuniciowych (DSB), na które komórki reagują mechanizmami naprawczymi.

Łączenie niehomologicznych końców (NHEJ) bezpośrednio łączy DNA z obu stron pęknięcia podwójnej nici, gdzie zachodzi bardzo małe lub żadne nakładanie się sekwencji w celu wyżarzania. Ten mechanizm naprawy indukuje błędy w genomie poprzez indele (insercja lub delecja) lub rearanżacja chromosomów; wszelkie takie błędy mogą spowodować, że produkty genów zakodowane w tej lokalizacji staną się niefunkcjonalne. Ponieważ ta aktywność może się różnić w zależności od gatunku, typu komórki, genu docelowego i zastosowanej nukleazy, należy ją monitorować podczas projektowania nowych systemów. Można przeprowadzić prosty test rozszczepienia heterodupleksów, który wykryje jakąkolwiek różnicę między dwoma allelami zamplifikowanymi przez PCR. Produkty rozszczepiania można wizualizować na prostych żelach agarozowych lub układach żeli płytkowych.

Alternatywnie, DNA można wprowadzić do genomu przez NHEJ w obecności egzogennych dwuniciowych fragmentów DNA.

Naprawa ukierunkowana na homologię może również wprowadzić obcy DNA do DSB, ponieważ transfekowane sekwencje dwuniciowe są używane jako matryce dla enzymów naprawczych.

Aplikacje

TALEN został wykorzystany do skutecznej modyfikacji genomów roślin, tworząc ważne gospodarczo rośliny spożywcze o korzystnych właściwościach odżywczych. Wykorzystano je również do opracowania narzędzi do produkcji biopaliw . Ponadto został wykorzystany do opracowania stabilnie zmodyfikowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i klonów indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (IPSC) oraz ludzkich linii komórek erytroidalnych w celu wytworzenia knockout C. elegans , szczurów z nokautem , myszy z nokautem i danio pręgowanego z nokautem . Ponadto sposób ten może być stosowany do generowania organizmów pukających. Wu i wsp. uzyskali bydło z pukaniem Sp110 przy użyciu nikaz Talen w celu wywołania zwiększonej odporności na gruźlicę. Podejście to zastosowano również do generowania szczurów knockin przez mikroiniekcję mRNA TALEN w zarodkach jednokomórkowych.

TALEN był również wykorzystywany eksperymentalnie do korygowania błędów genetycznych leżących u podstaw choroby. Na przykład był używany in vitro do korygowania defektów genetycznych, które powodują zaburzenia, takie jak niedokrwistość sierpowatokrwinkowa , xeroderma pigmentosum i pęcherzowe oddzielanie się naskórka . Niedawno wykazano, że TALEN można wykorzystać jako narzędzie do okiełznania układu odpornościowego do walki z nowotworami; Celowanie za pośrednictwem TALEN może generować komórki T, które są oporne na leki chemioterapeutyczne i wykazują aktywność przeciwnowotworową.

Teoretycznie specyficzność całego genomu zmodyfikowanych fuzji TALEN pozwala na korektę błędów w poszczególnych loci genetycznych poprzez naprawę ukierunkowaną na homologię z prawidłowego szablonu egzogennego. W rzeczywistości jednak in situ TALEN jest obecnie ograniczone przez brak skutecznego mechanizmu dostarczania, nieznane czynniki immunogenne i niepewność co do specyficzności wiązania TALEN.

Innym pojawiającym się zastosowaniem TALEN jest jego zdolność do łączenia z innymi narzędziami inżynierii genomu, takimi jak meganukleazy . Region wiążący DNA efektora TAL można połączyć z domeną cięcia meganukleazy, aby stworzyć hybrydową architekturę łączącą łatwość inżynierii i wysoce specyficzną aktywność wiązania DNA efektora TAL z niską częstotliwością i specyficznością meganukleazy.

W porównaniu z innymi technikami edycji genomu TALEN plasuje się pośrodku pod względem trudności i kosztów. W przeciwieństwie do ZFN , TALEN rozpoznaje pojedyncze nukleotydy. O wiele łatwiej jest zaprojektować interakcje między domenami wiążącymi DNA TALEN a ich docelowymi nukleotydami niż tworzyć interakcje z ZFN i ich docelowymi trypletami nukleotydowymi. Z drugiej strony CRISPR opiera się na tworzeniu kompleksów rybonukleotydowych zamiast na rozpoznawaniu białka/DNA. gRNA mają czasami ograniczenia dotyczące wykonalności z powodu braku miejsc PAM w sekwencji docelowej i chociaż można je tanio wyprodukować, obecny rozwój prowadzi do znacznego obniżenia kosztów TALEN, dzięki czemu są one w podobnej cenie i przedziale czasowym jak Edycja genomu oparta na CRISPR.

Precyzja nukleazy efektorowej TAL

Aktywność aktywnej nukleazy poza celem może prowadzić do niepożądanych pęknięć dwuniciowych, aw konsekwencji do rearanżacji chromosomów i/lub śmierci komórki. Przeprowadzono badania w celu porównania względnej toksyczności dostępnej technologii związanej z nukleazami. Na podstawie tych badań i maksymalnej teoretycznej odległości między wiązaniem DNA a aktywnością nukleazy uważa się, że konstrukty TALEN mają największą precyzję spośród obecnie dostępnych technologii.

Zobacz też

Linki zewnętrzne

E-TALEN.org Kompleksowe narzędzie do projektowania TALEN
PDB Molecule of the Month Wpis w miesięcznym wyróżnieniu strukturalnym Białkowej Bazy Danych