PNGaza F
 | |||||||
| Peptyd: | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| identyfikatory N-glikozydazy F | |||||||
| Symbol | PNGaza F | ||||||
| WPB | 1PGS | ||||||
| UniProt | Q9XBM8 | ||||||
| |||||||
Peptyd:N-glikozydaza F , powszechnie określana jako PNGaza F , jest amidazą z klasy amidazy peptydo-N4-(N-acetylo-beta-glukozaminylo)asparaginowej . PNGaza F działa poprzez rozszczepianie między najbardziej wewnętrznymi resztami GlcNAc i asparaginy oligosacharydów o wysokiej zawartości mannozy , hybryd i złożonych z N-glikoprotein i glikopeptydów. Prowadzi to do zdeaminowanego białka lub peptydu i wolnego glikanu .
PNGaza F ma masę cząsteczkową 35 500 i składa się z łańcucha polipeptydowego o długości 314 aminokwasów. Optymalne pH dla aktywności enzymu wynosi 8,6. Jednak aktywność jest stabilna w wielu różnych warunkach i odczynnikach. PNGaza F zachowuje 60% aktywności od pH 6,0 do pH 9,5. Jest zdolny do deglikozylacji pod nieobecność denaturantów, ale wymaga intensywnej inkubacji i większych ilości enzymu do rozszczepienia białek natywnych.
Inne endoglikozydazy , podobne do PNGazy F, obejmują endoglikozydazę F1, endoglikozydazę F2, endoglikozydazę F3 i endoglikozydazę H. Te endoglikozydazy mają większą specyficzność w rozszczepianiu i są mniej wrażliwe na konformację białka niż PNGaza F. Wszystkie te endoglikozydazy, w tym PNGaza F, mogą być oczyszczone z emulsji migdałowej lub z flavobacterium meningosepticum .
Mechanizm
PNGaza F katalizuje rozszczepienie wewnętrznego wiązania glikozydowego w oligosacharydzie. Rozszczepia wszystkie połączone z asparaginą kompleksy, hybrydy lub oligosacharydy o wysokiej zawartości mannozy, chyba że rdzeń GlcNAc zawiera alfa-1,3-fukozę.
Pozostałość asparaginy, z której usunięto glikan, jest deaminowana do kwasu asparaginowego .
PNGaza F wymaga co najmniej dwóch reszt oligosacharydowych GlcNAc przyłączonych do asparaginy, aby mogła zajść kataliza. Enzym ten wykorzystuje katalityczną triadę cysteiny-histydyny-asparaginianu w swoim miejscu aktywnym, co jest częstym motywem dla amidaz. Ten motyw zawiera nukleofil , donor protonów i ładunek dodatni, aby ustabilizować czworościenny związek pośredni . Stwierdzono, że struktura krystaliczna PNGazy F z flavobacterium miningosepticum, o rozdzielczości 1,8 Å, jest złożona w dwóch domenach, z których każda ma ośmioniciową antyrównoległą beczkę β lub galaretka, konfiguracja. Ta struktura jest podobna do lektyn i glukanaz , co sugeruje podobieństwa z lektynami i innymi białkami wiążącymi węglowodany.
Zastosowania i zastosowania
Z biologicznego punktu widzenia niedobory endoglikozydaz mogą prowadzić do kilku chorób, w tym lizosomalnych chorób spichrzeniowych i chorób wieloukładowych, z których większość dotyczy układu nerwowego. N-glikany mogą zapewniać składniki strukturalne ścian komórkowych i macierzy pozakomórkowych, modyfikować stabilność i rozpuszczalność białek, kierować innymi glikoproteinami i pośredniczyć w sygnalizacji komórkowej (interakcje komórka-komórka i interakcje komórka-macierz). N-glikozylację można zaobserwować w przeciwciałach , na powierzchniach komórek i na różnych białkach w całej macierzy. Zmiany w glikozylacji są często nabywane w przypadkach raka i stanów zapalnych, co może mieć ważne konsekwencje funkcjonalne.
W tym celu PNGazę F i inne endoglikozydazy można wykorzystać do badania oligosacharydów i charakteryzowania glikoprotein. PNGaza F nie ma selektywności względem zewnętrznej struktury węglowodanów, co skutkuje szeroką specyficznością, co czyni ją użytecznym narzędziem do badania struktury i funkcji glikoprotein. W większości przypadków białka będące przedmiotem zainteresowania są denaturowane i traktowane PNGazą F. Następnie są one albo poddawane elektroforezie żelowej , w której zmienia się migracja białek w wyniku deglikozylacji przez PNGazę F, albo są analizowane za pomocą spektrometrii mas , za pomocą którego można scharakteryzować oligosacharyd i można scharakteryzować białko lub fragment peptydowy, z którego pochodzi.