Punkt początkowy (drożdże)
Punkt kontrolny Start jest głównym punktem kontrolnym cyklu komórkowego u drożdży. Punkt kontrolny Start zapewnia nieodwracalne wejście w cykl komórkowy, nawet jeśli warunki później staną się niekorzystne. Czynniki fizjologiczne kontrolujące przejście przez punkt kontrolny Start obejmują zewnętrzne stężenia składników odżywczych, obecność czynnika godowego/feromonu, formy stresu i kontrolę wielkości.
Wczesna charakterystyka Startu
Próbując zbadać uporządkowane zdarzenia cyklu komórkowego, Leland Hartwell i in. przebadano i scharakteryzowano mutanty wrażliwe na temperaturę, znane również jako mutanty cyklu podziału komórkowego (mutanty cdc), które wykazują zatrzymanie rozwoju komórkowego na różnych etapach cyklu. Hartwell nie tylko zidentyfikował mutanta cdc28, który ulega zatrzymaniu w bardzo wczesnych stadiach cyklu komórkowego, ale także zauważył, że obecność czynników krzyżujących może skutkować podobnym fenotypem zahamowania tworzenia pąków i braku syntezy DNA. W szczególności komórki wystawione na działanie czynników współpracujących na późniejszych etapach cyklu podział kontynuował i został zatrzymany dopiero, gdy powstałe komórki potomne osiągnęły „wczesne etapy” (lub bardziej technicznie fazę G1) cyklu komórkowego. Wyniki te sugerują, że zarówno cdc28, jak i feromony godowe pośredniczą w takich wczesnych zdarzeniach, a ponadto sugerują, że istnieje punkt w cyklu komórkowym, w którym komórka angażuje się raczej w podział niż w krycie. Hartwell nazwał ten punkt „Początkiem”, w którym komórki są wrażliwe na feromony godowe przed osiągnięciem tego etapu, ale później są niewrażliwe na czynniki godowe.
W latach następujących po pracochłonnych eksperymentach Hartwella wykazano, że inne czynniki środowiskowe wpływają na los komórek drożdży i analogicznie w innych organizmach. Choć nie jest to specyficzne dla drożdży, krytyczne badanie przeprowadzone przez Zetterberga i in . w 1985 r. dostarczył dowodów na punkt zaangażowania w szwajcarskich komórkach 3T3, czyli fibroblastach zarodków myszy, hodowanych w warunkach bogatych w surowicę lub pozbawionych surowicy. Podobnie jak reakcja na feromony godowe w eksperymentach Hartwella, reakcja na niedobór surowicy nie była jednakowa wśród wszystkich komórek. Tylko komórki postmitotyczne młodsze niż trzy godziny zatrzymywały podział komórkowy w tych warunkach, podczas gdy komórki starsze niż cztery godziny były niewrażliwe na brak czynników wzrostu. Te wyniki eksperymentów wykazują mocne dowody na to, że punkt zaangażowania wchodzi w mitozę i w konsekwencji sugerują, że komórka jest zdolna do wyczuwania swojego otoczenia pod kątem takich wskazówek, jak czynniki wzrostu, przed zatwierdzeniem.
Transkrypcja genów G1/S
Transkrypcja kilku genów G1/S jest niezbędna, aby komórki mogły przejść przez cykl komórkowy. U pączkujących drożdży transkrypcja ponad 200 genów jest aktywowana w momencie przejścia G1/S. Transkrypcja tych genów G1/S jest regulowana głównie przez dwa białka regulatorowe genów, SBF i MBF. Te białka regulatorowe tworzą kompleksy odpowiednio z SCB i MCB, które są zlokalizowane na promotorach genów G1/S.
Białka regulatorowe SBF i MBF
dysocjacji białka inhibitorowego znanego jako Whi5 . Dysocjacja Whi5 wymaga fosforylacji przez kompleks Cln3- Cdk1 . Wskazuje to, że aktywność Cln3-Cdk1 odgrywa ważną rolę w punkcie kontrolnym Start ze względu na konieczność jednoczesnej aktywacji białek SBF i MBF. Aktywność Cln3 koreluje z tempem wzrostu komórek.
Aktywacja S-Cdks przez G1/S-Cdks
Geny G1/S obejmują cykliny Cln1 i Cln2, które mogą tworzyć aktywne kompleksy z Cdk1. Te aktywowane kompleksy Cln-Cdk pomagają aktywować kompleksy S-Cdk, które są normalnie hamowane przez Sic1. Sic1 nie ma wpływu na kompleksy Cln-Cdk. Kompleksy Cln-Cdk aktywują kompleksy S-Cdk poprzez zniszczenie Sic1 przez fosforylację , a następnie ubikwitynację SCF .
Czynnik godowy/feromon
Interakcje białek między szlakiem kojarzenia a progresją cyklu komórkowego
Reakcja na feromony godowe opisana w eksperymentach Hartwella nie jest zaskakująca, biorąc pod uwagę antagonistyczne interakcje biochemiczne pomiędzy szlakiem godowym a cyklinami G1, które promują progresję cyklu komórkowego.
Jak pokazano na załączonym rysunku, szlak kojarzenia składa się z kaskady MAPK (kinazy białkowej aktywowanej mitogenami), w której Ste5 pośredniczy w sygnale feromonowym i dalszych odpowiedziach kinazowych przez Ste11, Ste7 i Fus3. Ze swoich dalszych, a nawet bezpośrednich skutków, Fus3 ostatecznie aktywuje Far1, który bezpośrednio hamuje aktywność cyklin G1, Cln1/2.
Z kolei Cln1/2 bezpośrednio hamuje szlak kojarzenia poprzez hamowanie Far1 i Ste5. W aktywności Cln1/2 pośredniczy aktywacja znajdującej się wyżej cykliny G1, Cln3. Cln3 wraz z kinazą zależną od cyklin Cdc28 inaktywuje i promuje eksport jądrowego Whi5. Eksport Whi5 powoduje częściową aktywację czynników transkrypcyjnych SBF i MBF, które ostatecznie sprzyjają progresji cyklu komórkowego. Te czynniki transkrypcyjne promują ekspresję Cln1/2 i wzmacniają odpowiedź cyklu komórkowego poprzez utworzenie pętli dodatniego sprzężenia zwrotnego, ponieważ Cln1/2 promuje aktywację SBF i eksport Whi5.
Ilościowy opis początku
Doncic i in. przeprowadzili współczesne badanie określające związek między zatrzymaniem krycia a progresją cyklu komórkowego. w czerwcu 2011 r. Uznając, że ilość jądrowego Whi5 jest wskaźnikiem aktywności cykliny G1, autorzy postanowili ilościowo zrozumieć moment, w którym komórki podejmują podział. Za pomocą platformy mikroprzepływowej asynchroniczną populację komórek wystawiono na działanie feromonu, czynnika alfa. Używając białka fuzyjnego Whi5-GFP, śledzono ilość jądrowego Whi5 po dodaniu czynnika alfa i sprawdzano, czy komórka zatrzymała się, czy kontynuowała podział. Zgodnie z oczekiwaniami komórki Pre-Start zatrzymały podział komórkowy po dodaniu feromonu, na co wskazuje niewielka część eksportu Whi5. I odwrotnie, komórki po starcie były niewrażliwe na współczynnik alfa i ciągły podział, co odzwierciedla duża część eksportu Whi5. Zatem zróżnicowana reakcja na obecność feromonów znajduje odzwierciedlenie w tym, czy komórka znajduje się przed, czy po starcie, co można scharakteryzować na podstawie ilości Whi5 obecnego w jądrze. Następnie zastosowano regresję logistyczną do obliczenia prawdopodobieństwa zatrzymania w stosunku do frakcji wyeksportowanego Whi5 i wykazała ostrą zmianę między zatrzymaniem a progresją, gdy około 50% Whi5 zostało wyeksportowane z jądra. Wykazano również, że ta część eksportowanego Whi5 odpowiada aktywacji pętli dodatniego sprzężenia zwrotnego Cln1/2 (patrz poniżej). Podsumowując, wskazuje to, że Start jest zdefiniowany przez aktywację pętli sprzężenia zwrotnego Cln1/2.
Rola Whi5 w progresji cyklu komórkowego
Jak wspomniano powyżej, cykliny G1, Cln1/2, są częścią pętli dodatniego sprzężenia zwrotnego, która promuje ich własną transkrypcję i aktywację czynników transkrypcyjnych SBF i MBF. W 2008 roku Skotheim i in. zaproponowali, że ta pętla sprzężenia zwrotnego pozwala na silny sygnał zaangażowany w podział komórkowy przez geny regulowane przez SBF i MBF. Postawili hipotezę, że bez spójnej ekspresji genów niezbędnych do wczesnych zdarzeń, takich jak replikacja DNA i tworzenie pąków, losowe indywidualne sygnały komórkowe wytwarzają szum, który osłabia reakcję zaangażowania. Odnotowując długie i asynchroniczne czasy indukcji CLN2 i RAD27 (gen w regulonie SBF/MBF) w komórkach cln1∆cln2∆ w porównaniu z typem dzikim, Skotheim i in. w ten sposób wywnioskowano, że mechanizm dodatniego sprzężenia zwrotnego Cln1/2 pozwala na synchroniczną i bardziej efektywną ekspresję regulonu SBF/MBF.
Autorzy zaobserwowali ponadto, że fosforylacja Whi5 i wynikająca z niej inaktywacja odgrywają rolę w tej pozytywnej odpowiedzi zwrotnej. Allel Whi5 pozbawiony sześciu z dwunastu miejsc fosforylacji powoduje powolne wyjście z jądra, a w konsekwencji mniej spójną indukcję ekspresji CLN2 i RAD27. Zatem niezdolność do fosforylacji Whi5 zakłóca pętlę dodatniego sprzężenia zwrotnego Cln1/2, co z kolei zmniejsza spójną ekspresję regulonu.
Dynamika molekularna między szlakiem kojarzenia a progresją cyklu komórkowego
Aby dokładniej wyjaśnić biochemiczne wyjaśnienie pomiędzy zatrzymaniem kojarzenia a zaangażowaniem w cykl komórkowy, Doncic i in. przeprowadził ten sam test zaangażowania opisany powyżej na różnych zmutowanych szczepach. Mutant FAR1-S87A nie ma miejsc fosforylacji CDK, a zatem hamowanie Far1 przez Cln1/2 jest zagrożone. Rezultatem jest wzrost ilości eksportu Whi5 wymaganego do zaangażowania się w podział komórkowy, co sugeruje, że fosforylacja Far 1 jest kluczem do zaangażowania komórkowego. I odwrotnie, mutant STE5-8A, któremu brakuje również miejsc fosforylacji CDK (a zatem hamowanie Ste5 przez Cln1/2 jest zagrożone), nie przesuwa punktu zaangażowania, co sugeruje, że takie hamowanie szlaku kojarzenia nie jest krytyczne dla Start. Dalsza analiza komórek STE5-8A poklatkowa ujawnia, że te zmutowane komórki nie mogą w pełni zaangażować się w podział komórkowy, ponieważ komórki wystawione na działanie czynnika alfa pączkują, a następnie powracają do kojarzenia bez zakończenia cyklu komórkowego. Doncić i in. zaproponowali, że niekompletny podział był spowodowany ekspresją genów zarówno na szlaku kojarzenia, jak i w progresji komórkowej kierowanej cykliną G1. Rzeczywiście, śledzenie ekspresji FUS1pr-GFP, genu szlaku kojarzenia i CLN2pr-mCherry, genu cyklu komórkowego, wykazało dużą koekspresję w komórkach STE5-8A w porównaniu z komórkami typu dzikiego.
Zatem hamowanie Far1 przez Cln1/2 umożliwia wejście w cykl komórkowy (Start), podczas gdy hamowanie Ste5 gwarantuje wyraźną ekspresję genów albo dla szlaku kojarzenia, albo dla progresji cyklu komórkowego.
Kontrola wzrostu i wielkości składników odżywczych komórek
Zewnętrzne stężenia składników odżywczych są niezwykle ważne, aby przejść przez punkt kontrolny Start. Dostępność składników odżywczych jest silnie skorelowana z wielkością wzrostu komórek. Komórki nie będą działać, jeśli nie osiągną określonego rozmiaru z powodu braku składników odżywczych, zwykle azotu. Zatem większe komórki spędzają mniej czasu w punkcie kontrolnym Start w porównaniu z mniejszymi komórkami.