Stabilna cząsteczka lipidowa kwasu nukleinowego
Stabilne cząstki lipidowe kwasu nukleinowego ( SNALP ) to mikroskopijne cząstki o średnicy około 120 nanometrów , mniejsze niż długość fali światła widzialnego. Stosowano je do terapeutycznego dostarczania siRNA ssakom in vivo . W SNALP siRNA jest otoczone dwuwarstwą lipidową zawierającą mieszaninę lipidów kationowych i fuzogennych , pokrytą dyfundującym glikolem polietylenowym .
Wstęp
Interferencja RNA (RNAi) jest procesem zachodzącym naturalnie w cytoplazmie, hamującym ekspresję genów w określonych sekwencjach. Regulacja ekspresji genów poprzez RNAi jest możliwa dzięki wprowadzeniu małych interferujących RNA (siRNA), które skutecznie wyciszają ekspresję docelowego genu. RNAi aktywuje indukowany przez RNA kompleks wyciszający (RISC) zawierający siRNA, siRNA pochodzące z rozszczepionego dsRNA. SiRNA kieruje kompleks RISC do określonej sekwencji na mRNA, która jest cięta przez RISC iw konsekwencji wycisza te geny.
Jednak bez modyfikacji szkieletu RNA lub włączenia odwróconych zasad na każdym końcu, niestabilność siRNA w osoczu bardzo utrudnia zastosowanie tej techniki in vivo . Receptory rozpoznawania wzorców (PRR), które można pogrupować jako endocytarne PRR lub sygnalizujące PRR, ulegają ekspresji we wszystkich komórkach wrodzonego układu odpornościowego . W szczególności sygnalizujące PRR obejmują receptory Toll-podobne (TLR) i są zaangażowane głównie w identyfikację wzorców molekularnych związanych z patogenami (PAMP). Na przykład TLR mogą rozpoznawać określone regiony konserwowane w różnych patogenach, rozpoznanie stymulujące odpowiedź immunologiczną z potencjalnie niszczącymi skutkami dla organizmu. W szczególności TLR 3 rozpoznaje zarówno dsRNA charakterystyczne dla replikacji wirusa, jak i siRNA, który również jest dwuniciowy. Oprócz tej niestabilności, inne ograniczenie terapii siRNA dotyczy niemożności ukierunkowania na tkankę z jakąkolwiek specyficznością.
SNALP mogą jednak zapewniać stabilność i specyficzność wymaganą, aby ten tryb terapii RNAi był skuteczny. Składające się z dwuwarstwy lipidowej SNALP są w stanie zapewnić stabilność siRNA, chroniąc je przed nukleazami w osoczu, które mogłyby je rozłożyć. Ponadto dostarczanie siRNA podlega endosomalnemu , potencjalnie narażając je na TLR3 i TLR7 , i może prowadzić do aktywacji interferonów i cytokin prozapalnych . Jednak SNALP umożliwiają wychwyt siRNA do endosomu bez aktywowania receptorów Toll-podobnych iw konsekwencji stymulowania hamującej odpowiedzi immunologicznej, umożliwiając w ten sposób ucieczkę siRNA z endosomu.
Rozwój dostarczania siRNA przez SNALP
Regulacja w dół ekspresji genów przez siRNA była ważnym narzędziem badawczym w badaniach in vitro . Jednak podatność siRNA na degradację nukleazami sprawia, że ich wykorzystanie in vivo jest problematyczne. W 2005 roku naukowcy pracujący z wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV) u gryzoni ustalili, że pewne modyfikacje siRNA zapobiegają degradacji przez nukleazy w osoczu i prowadzą do zwiększonego wyciszania genów w porównaniu z niezmodyfikowanym siRNA. Modyfikacje sensu i antysensu nici zostały wykonane różnie. W odniesieniu zarówno do nici sensownej, jak i antysensownej, 2'-OH podstawiono 2'-fluoro we wszystkich pozycjach pirymidynowych . Ponadto nici sensowne modyfikowano we wszystkich pozycjach purynowych dezoksyrybozą, nici antysensowne modyfikowano 2'- O -metylem w tych samych pozycjach. Końce 5' i 3' nici sensownej były zakończone bezzasadowymi odwróconymi powtórzeniami, podczas gdy fosforotionianowe zostało włączone na końcu 3' nici antysensownej.
Chociaż badania te wykazały potencjalną terapię RNAi przy użyciu zmodyfikowanego siRNA, 90% redukcja DNA HBV u gryzoni wynikała z dawki 30 mg/kg przy częstym podawaniu. Ponieważ nie jest to opłacalny schemat dawkowania, ta sama grupa przyjrzała się skutkom kapsułkowania siRNA w dwuwarstwie PEGylowanych lipidów lub SNALP. Konkretnie, dwuwarstwa lipidowa ułatwia pobieranie do komórki, a następnie uwalnianie z endosomu, PEGylowana warstwa zewnętrzna zapewnia stabilność podczas formułowania ze względu na wynikającą z tego hydrofilowość z zewnątrz. Według tego badania z 2005 r. naukowcy uzyskali 90% redukcję DNA HBV przy dawce 3 mg/kg/dobę siRNA przez trzy dni, czyli dawce znacznie niższej niż we wcześniejszym badaniu. Ponadto, w przeciwieństwie do niezmodyfikowanego lub zmodyfikowanego i nieotoczkowanego siRNA, podawanie siRNA dostarczonego przez SNALP nie skutkowało wykrywalnymi poziomami interferonów , takich jak IFN-a, lub cytokin zapalnych związanych z immunostymulacją. Mimo to naukowcy uznali, że konieczne są dalsze prace, aby osiągnąć wykonalną dawkę i reżim dawkowania.
W 2006 roku badacze pracujący nad wyciszeniem apolipoproteiny B (ApoB) u naczelnych osiągnęli 90% wyciszenia za pomocą pojedynczej dawki 2,5 mg/kg siRNA specyficznego dla APOB dostarczonego przez SNALP. ApoB jest białkiem biorącym udział w składaniu i wydzielaniu lipoprotein o bardzo małej gęstości (VLDL) i lipoprotein o małej gęstości (LDL) i ulega ekspresji głównie w wątrobie i jelicie czczym . Zarówno VLDL, jak i LDL są ważne w cholesterolu transportu i jego metabolizmu. Nie tylko ten stopień wyciszenia zaobserwowano bardzo szybko, w około 24 godziny po podaniu, ale efekty wyciszenia utrzymywały się przez ponad 22 dni już po pojedynczej dawce. Naukowcy przetestowali również pojedynczą dawkę 1 mg/kg, uzyskując 68% wyciszenie genu docelowego, co wskazuje na wyciszenie zależne od dawki. To zależne od dawki wyciszenie było widoczne nie tylko w stopniu wyciszenia, ale także w czasie trwania wyciszenia, przy czym ekspresja genu docelowego powracała 72 godziny po podaniu.
Chociaż SNALP o średnicy 100 nm były skutecznie stosowane do celowania w określone geny w celu wyciszenia, istnieje wiele barier ogólnoustrojowych, które odnoszą się konkretnie do wielkości. Na przykład, dyfuzja do guzów litych jest utrudniona przez duże SNALP i podobnie, komórki objęte stanem zapalnym o zwiększonej przepuszczalności i retencji utrudniają wejście dużym SNALP. Ponadto eliminacja siateczkowo-śródbłonkowa , selektywność wielkości bariery krew-mózg i ograniczenia okienek kapilarnych wszystkie wymagają mniejszego SNALP w celu skutecznego dostarczania siRNA specyficznego dla celu. W 2012 roku naukowcy z Niemiec opracowali coś, co nazwali „mono-NALP”, stosując dość prostą metodę wymiany rozpuszczalnika, obejmującą stopniowe rozcieńczanie 50% roztworu izopropanolu. Rezultatem jest bardzo stabilny system dostarczania podobny do tradycyjnych SNALP, ale mający tylko średnicę 30 nm. Opracowane tutaj mono-NALP są jednak nieaktywne, ale mogą stać się aktywnymi nośnikami poprzez wdrożenie określonych mechanizmów celowania i uwalniania stosowanych przez podobne systemy dostarczania.
Aplikacje
Wirus Ebola Zairu (ZEBOV)
Byliśmy w stanie zapewnić pełną ochronę za pomocą puli siRNA zamkniętych w SNALP lub pojedynczych siRNA SNALP, w zależności od ich względnej siły… [ najsilniejszy siRNA] … zapewniał absolutną ochronę, czyli 100 procent przeżycia, a także przyczyniły się do całkowitej awiremii u zakażonych świnek morskich. Tak więc nie było wykrywalnego wirusa Ebola, mimo że zwierzęta zostały zaszczepione zasadniczo 30 000 razy większą zakaźną dawką wirusa.
— Thomas Geisbert, USAMRIID , maj 2006
W maju 2010 r. na pierwszych stronach gazet pojawiła się informacja o zastosowaniu SNALP przeciwko wirusowi Ebola Zair, ponieważ preparat był w stanie wyleczyć makaki rezus , gdy został podany krótko po ekspozycji na śmiertelną dawkę wirusa, która może być nawet w 90% śmiertelna dla ludzi w sporadyczne ogniska w Afryce. Terapia zastosowana w przypadku makaków rezus składała się z trzech siRNA (naprzemiennych dupleksów RNA) ukierunkowanych na trzy geny wirusowe. przez spontaniczne pęcherzyki z mieszaniny cholesterolu , dipalmitoilofosfatydylocholiny , 3-N-[(ω-metoksypoli(glikol etylenowy)2000)karbamoilo]-1,2-dimyrestyloksypropyloamina i kationowy 1,2-dilinoleiloksy-3-N,N-dimetyloaminopropan.
Oprócz stosowania makaka rezus , udowodniono również, że SNALP chronią cavia porcellua przed wiremią i śmiercią, gdy są podawane krótko po ekspozycji na ZEBOV. System dostarczania siRNA specyficzny dla genu polimerazy (L) został nałożony na cztery geny związane z wirusowym genomowym RNA w kompleksie rybonukleoproteinowym znajdującym się w cząsteczkach EBOV (z których trzy pasują do powyższego zastosowania): NP, VP30, VP35 i białko L . SNALP miały rozmiar od 71 do 84 nm i składały się z syntetycznego cholesterolu, fosfolipidu DSPC, lipidu PEG PEGC-DMA i lipidu kationowego DLinDMA w stosunku molowym 48:20:2:30. Wyniki potwierdzają całkowitą ochronę przed wiremią i śmiercią świnek morskich po podaniu systemu dostarczania SNALP-siRNA po zdiagnozowaniu wirusa Ebola, co dowodzi, że ta technologia jest skuteczna w leczeniu. Przyszłe badania skupią się głównie na ocenie wpływu „koktajli” siRNA na geny EBOV w celu zwiększenia efektów przeciwwirusowych.
Rak wątrobowokomórkowy
W 2010 roku naukowcy opracowali odpowiednią terapię ukierunkowaną na raka wątrobowokomórkowego (HCC) u ludzi. Identyfikacja CSN5, piątej podjednostki kompleksu sygnałosomu COP9 występującego we wczesnym HCC, została wykorzystana jako cel terapeutyczny dla indukcji siRNA. Ogólnoustrojowe dostarczanie zmodyfikowanego CSN5siRNA zamkniętego w SNALP znacząco hamowało wzrost guza wątroby w ortotopowym modelu ksenoprzeszczepu Huh7-luc + ludzkiego raka wątroby. Udowodniono również, że knockdown CSN5 za pośrednictwem siRNA hamuje progresję cyklu komórkowego i zwiększa szybkość apoptozy w komórkach HCC in vitro. Wyniki te nie tylko pokazują rolę CSN5 w progresji raka wątroby, ale także wskazują, że CSN5 odgrywa zasadniczą rolę w patogenezie HCC. Podsumowując, udowodniono, że SNALP znacząco zmniejszają wzrost guza raka wątrobowokomórkowego w ludzkich komórkach Huh7-luc* poprzez wyciszenie terapeutyczne.
Nowotwory
W 2009 roku naukowcy opracowali siRNA zdolne do kierowania zarówno kinazy typu polo 1 ( PLK1 ), jak i białka wrzeciona kinezyny (KSP). Oba białka są ważne dla cyklu komórkowego komórek nowotworowych, PLK1 bierze udział w fosforylacji różnych białek, a KSP jest integralną częścią segregacji chromosomów podczas mitozy . Konkretnie, dwubiegunowe wrzeciona mitotyczne nie mogą się tworzyć, gdy KSP jest hamowane, co prowadzi do zatrzymania cyklu komórkowego i ostatecznie do apoptozy . Podobnie, hamowanie PLK1 ułatwia zatrzymanie mitozy i apoptozę komórek. Zgodnie z badaniem, dawka 2 mg/kg siRNA specyficznego dla PLK1 podawana przez 3 tygodnie myszom, którym wszczepiono guzy, spowodowała wydłużenie czasu przeżycia i oczywistą redukcję guzów. W rzeczywistości średni czas przeżycia leczonych myszy wynosił 51 dni w porównaniu z 32 dniami w grupie kontrolnej. Ponadto tylko 2 z 6 leczonych myszy miały zauważalne guzy wokół miejsca implantacji. Mimo to GAPDH , sygnał pochodzący z guza, był obecny na niskim poziomie, co wskazuje na znaczne zahamowanie wzrostu guza, ale nie na całkowitą eliminację. Mimo to wyniki sugerowały minimalne toksyczność i brak istotnej dysfunkcji szpiku kostnego. Zwierzęta leczone siRNA specyficznym dla KSP również wykazywały wydłużony czas przeżycia do 28 dni w porównaniu z 20 dniami w grupie kontrolnej.