Test hybrydyzacji
Test hybrydyzacji obejmuje dowolną formę mierzalnej hybrydyzacji , tj. ilościowe przyłączanie dwóch komplementarnych nici kwasów nukleinowych , znane jako hybrydyzacja kwasu nukleinowego .
Przegląd
W kontekście biochemii i opracowywania leków test hybrydyzacji jest rodzajem testu wiązania ligandu (LBA) stosowanego do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych w matrycach biologicznych. Testy hybrydyzacji mogą być przeprowadzane w roztworze lub na podłożu stałym, takim jak 96-dołkowe płytki lub znakowane kulki.
Testy hybrydyzacji obejmują znakowane sondy kwasów nukleinowych w celu identyfikacji pokrewnych cząsteczek DNA lub RNA (tj. o znacząco wysokim stopniu podobieństwa sekwencji) w złożonej mieszaninie nieznakowanych cząsteczek kwasu nukleinowego . Terapię antysensowną , siRNA i inne bioterapeutyki oparte na oligonukleotydach i kwasach nukleinowych można określić ilościowo za pomocą testów hybrydyzacji.
Sygnalizacja metodami hybrydyzacji może być przeprowadzona przy użyciu sond oligonukleotydowych modyfikowanych podczas syntezy z haptenami i małocząsteczkowymi ligandami , które działają homologicznie do przeciwciał wychwytujących i wykrywających. Podobnie jak w przypadku tradycyjnego testu ELISA , koniugaty peroksydazy chrzanowej (HRP) lub fosfatazy alkalicznej (AP) mogą być stosowane jako przeciwciała drugorzędowe.
Test hybrydyzacji kanapkowej
W teście ELISA z hybrydyzacją kanapkową ligand antygenu i przeciwciała w teście ELISA są zastępowane analitem kwasu nukleinowego, komplementarnymi oligonukleotydowymi sondami wychwytującymi i wykrywającymi.
Ogólnie, w przypadku hybrydyzacji kwasu nukleinowego, stężenie soli jednowartościowej i temperatura są kontrolowane pod kątem hybrydyzacji i rygorystyczności przemywania, w przeciwieństwie do tradycyjnego testu ELISA, w którym stężenie soli będzie zwykle ustalone dla etapów wiązania i przemywania (tj. PBS lub TBS). Zatem optymalne stężenie soli w testach hybrydyzacji zmienia się w zależności od długości i składu zasad analitu, sond wychwytujących i wykrywających.
Konkurencyjny test hybrydyzacji
Kompetycyjny test hybrydyzacji jest podobny do tradycyjnego kompetycyjnego testu immunologicznego . Podobnie jak inne testy hybrydyzacyjne, opiera się na komplementarności, w której sonda wychwytująca konkuruje między analitem a znacznikiem – znakowanym analogiem oligonukleotydu do analitu.
Test hybrydyzacji-ligacji
W teście hybrydyzacji-ligacji sonda matrycowa zastępuje sondę wychwytującą w teście kanapkowym w celu unieruchomienia na podłożu stałym. Sonda matrycowa jest w pełni komplementarna do analitu oligonukleotydowego i ma służyć jako substrat do ligazy DNA T4 . Sonda matrycowa ma dodatkowo dodatkowy odcinek komplementarny do sondy ligacyjnej, dzięki czemu sonda ligacyjna będzie ligować się na 3'-końcu analitu. Sonda ligacyjna, chociaż ogólna, jest podobna do sondy detekcyjnej, ponieważ jest wyznakowana, na przykład, digoksygeniną do dalszego przekazywania sygnału. Rygorystyczne mycie z niską zawartością soli lub bez soli usunie niezligowane produkty.
Ligacja analitu z sondą ligacyjną sprawia, że metoda jest specyficzna dla 3'-końca analitu, ligacja przez ligazę DNA T4 jest znacznie mniej wydajna w przypadku pętli wybrzuszenia, co miałoby miejsce w przypadku metabolitu 3' w wersji N-1 analitu, np. Specyficzność testu hybrydyzacji-ligacji dla ligacji na 3'-końcu jest szczególnie istotna, ponieważ dominującymi nukleazami we krwi są egzonukleazy 3' do 5' .
Jednym z ograniczeń tej metody jest to, że wymaga ona wolnej 3'-końcowej grupy hydroksylowej, która może nie być dostępna, gdy na przykład ugrupowania kierujące są przyłączone do 3'-końca. Ponadto, bardziej egzotyczne chemie kwasów nukleinowych z lekami oligonukleotydowymi mogą wpływać na aktywność ligazy, którą należy określić indywidualnie dla każdego przypadku.
Test hybrydyzacji z podwójną ligacją
Test hybrydyzacji z podwójną ligacją (DLA) rozszerza specyficzność testu hybrydyzacji-ligacji na specyficzną metodę dla związku macierzystego. Pomimo solidności, czułości i dodatkowej specyficzności testu hybrydyzacji-ligacji dla końca 3' analitu oligonkuleotydu, test hybrydyzacji-ligacji nie jest specyficzny dla końca 5' analitu.
DLA ma na celu ilościowe oznaczenie wyłącznie macierzystego związku oligonukleotydowego pełnej długości, z nienaruszonymi końcami 5' i 3'. Sondy DLA są ligowane na końcach 5' i 3' analitu przez wspólne działanie ligazy DNA T4 i kinazy polinukleotydowej T4 . Kinaza fosforyluje koniec 5' analitu, a ligaza połączy sondę wychwytującą z analitem i sondą wykrywającą. Sondy wychwytujące i wykrywające w DLA można zatem nazwać sondami ligacyjnymi. Jeśli chodzi o test hybrydyzacji-ligacji, DLA jest specyficzny dla związku macierzystego, ponieważ wydajność ligacji na wybrzuszonej pętli jest niska, a zatem DLA wykrywa analit pełnej długości z nienaruszonymi końcami 5' i 3'. DLA może być również stosowany do oznaczania poszczególnych metabolitów w matrycach biologicznych.
Ograniczenia testu hybrydyzacji-ligacji mają również zastosowanie do testu podwójnej ligacji, w którym koniec 5' oprócz końca 3' wymaga obecności wolnej grupy hydroksylowej (lub grupy fosforanowej). Ponadto ligazy DNA T4 są niekompatybilne z ligacją cząsteczek RNA jako dawcy (tj. RNA na końcu 5' ligacji). Dlatego antysensowne drugiej generacji , które zawierają 2'-O-metylo RNA, 2'-O-metoksyetyl lub zablokowane kwasy nukleinowe, mogą nie być zgodne z testem podwójnej ligacji.
Test hybrydyzacji nukleaz
Test hybrydyzacji nukleazy, zwany także testem cięcia nukleazy S1 , jest hybrydyzacyjnym testem ELISA opartym na teście ochrony przed nukleazą . Test wykorzystuje nukleazę S1 , która rozkłada jednoniciowy DNA i RNA na oligo- lub mononukleotydy, pozostawiając nienaruszone dwuniciowe DNA i RNA.
W teście hybrydyzacji z nukleazą analit oligonukleotydowy jest wychwytywany na podłożu stałym, takim jak płytka 96-dołkowa, za pomocą w pełni komplementarnej sondy tnącej. Po obróbce enzymatycznej przez nukleazę S1, sonda tnąca i sonda tnąca hybrydyzują z metabolitami, tj. krótszymi składnikami analitu, co pozwala na generowanie sygnału tylko z dupleksu tnącego sonda-analit o pełnej długości.
Test jest dobrze odporny na różne chemikalia, czego przykładem jest opracowanie testu nukleazowego dla morfolinooligonukleotydów .
Ta konfiguracja testu może nie być solidna i nie nadaje się do walidacji zgodnie z wytycznymi FDA dotyczącymi walidacji metod bioanalitycznych . Świadczy o tym brak opublikowanej metody, która została zweryfikowana zgodnie ze standardami określonymi przez FDA dla metod bioanalitycznych.