Zmienność pojedynczych komórek
W biologii komórkowej zmienność pojedynczych komórek występuje, gdy poszczególne komórki w skądinąd podobnej populacji różnią się kształtem, rozmiarem, pozycją w cyklu komórkowym lub cechami na poziomie molekularnym. Takie różnice można wykryć za pomocą nowoczesnych analizy pojedynczych komórek . Badanie zmienności w obrębie populacji komórek przyczynia się do zrozumienia procesów rozwojowych i patologicznych ,
Analiza pojedynczej komórki
Próbka komórek może wyglądać podobnie, ale komórki mogą różnić się indywidualnymi cechami, takimi jak kształt i rozmiar, poziomy ekspresji mRNA , genom lub liczba poszczególnych metabolitów . W przeszłości jedyne dostępne metody badania takich właściwości wymagały populacji komórek i zapewniały oszacowanie interesującej nas cechy, uśrednionej dla populacji, co mogło przesłaniać ważne różnice między komórkami. Analiza pojedynczej komórki pozwala naukowcom badać właściwości pojedynczej komórki z dużą dokładnością, ujawniając indywidualne różnice między populacjami i dostarczając nowych informacji w biologii molekularnej. Te indywidualne różnice są ważne w takich dziedzinach, jak biologia rozwoju, gdzie poszczególne komórki mogą przybierać różne " losy ” – stają się wyspecjalizowanymi komórkami, takimi jak neurony lub tkanka narządu – podczas wzrostu zarodka; w badaniach nad rakiem , gdzie poszczególne komórki złośliwe mogą różnić się w odpowiedzi na terapię; lub w chorobach zakaźnych , gdzie tylko podzbiór komórek w populacji zarazić się patogenem .
Widoki komórek na poziomie populacji mogą oferować zniekształcony obraz danych poprzez uśrednienie właściwości odrębnych podzbiorów komórek. Na przykład, jeśli połowa komórek z określonej grupy wykazuje ekspresję danego genu na wysokim poziomie, a reszta na niskim poziomie, wyniki analizy obejmującej całą populację mogą wyglądać tak, jakby wszystkie komórki wyrażały dany gen na średnim poziomie . W ten sposób analiza pojedynczych komórek pozwala naukowcom dokładniej badać procesy biologiczne i odpowiadać na pytania, na które inaczej nie można było odpowiedzieć.
Rodzaje zmienności
Zmienność ekspresji genów
Komórki o identycznych genomach mogą różnić się ekspresją swoich genów ze względu na różnice w ich wyspecjalizowanych funkcjach w organizmie, punkcie czasowym cyklu komórkowego , środowisku, a także hałasie i czynnikach stochastycznych . Tak więc dokładny pomiar ekspresji genów w poszczególnych komórkach pozwala naukowcom lepiej zrozumieć te krytyczne aspekty biologii komórkowej. Na przykład wczesne badanie ekspresji genów w poszczególnych komórkach muszki owocowej zarodki umożliwiły naukowcom odkrycie regularnych wzorców lub gradientów transkrypcji określonych genów na różnych etapach wzrostu, co pozwoliło na bardziej szczegółowe zrozumienie rozwoju na poziomie lokalizacji i czasu. Innym zjawiskiem w ekspresji genów, które można było zidentyfikować tylko na poziomie pojedynczej komórki, jest oscylacyjna ekspresja genów, w której gen jest okresowo włączany i wyłączany.
Ekspresję genów w pojedynczej komórce typowo oznacza się stosując RNA-seq . Po wyizolowaniu komórki protokół RNA-seq zazwyczaj składa się z trzech etapów: RNA jest poddawany odwrotnej transkrypcji do cDNA , cDNA jest amplifikowany w celu udostępnienia większej ilości materiału dla sekwenatora, a cDNA jest sekwencjonowany .
Zmienność sekwencji DNA
Populacja organizmów jednokomórkowych, takich jak bakterie, zwykle nieznacznie różni się sekwencją DNA z powodu mutacji nabytych podczas rozmnażania. W obrębie pojedynczego człowieka poszczególne komórki mają zwykle identyczne genomy, chociaż istnieją interesujące wyjątki, takie jak komórki B , które różnią się DNA, co umożliwia im generowanie różnych przeciwciał do wiązania się z różnymi patogenami, które mogą atakować organizm. Pomiar różnic i szybkości zmian w zawartości DNA na poziomie pojedynczej komórki może pomóc naukowcom lepiej zrozumieć, w jaki sposób patogeny rozwijają oporność na antybiotyki, dlaczego układ odpornościowy często nie jest w stanie wytworzyć przeciwciał przeciwko szybko mutującym wirusom, takim jak HIV, oraz inne ważne zjawiska.
Istnieje wiele technologii sekwencjonowania genomów, ale są one zaprojektowane tak, aby wykorzystywać DNA z populacji komórek, a nie pojedynczej komórki. Podstawowym wyzwaniem dla sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki jest wykonanie wielu kopii (wzmocnienie) DNA, tak aby dostępna była wystarczająca ilość materiału dla sekwencera, proces zwany amplifikacją całego genomu (WGA). Typowe metody WGA obejmują: (1) amplifikację wielokrotnego przemieszczenia (MDA), w której wiele starterów łączy się z DNA, polimerazy kopiują DNA i wybijają inne polimerazy, uwalniając nici, które mogą być przetwarzane przez sekwenator, (2) PCR oparte na metodach lub (3) pewna kombinacja obu.
Zmienność właściwości metabolomicznych
Komórki różnią się zawartością metabolitów , które są związkami pośrednimi i produktami końcowymi złożonych reakcji biochemicznych podtrzymujących komórkę. Genetycznie identyczne komórki w różnych warunkach i środowiskach mogą wykorzystywać różne szlaki metaboliczne, aby się utrzymać. Mierząc obecne metabolity, naukowcy mogą wywnioskować wykorzystywane szlaki metaboliczne i wywnioskować przydatne informacje o stanie komórki. Przykładem tego jest układ odpornościowy, gdzie komórki CD4+ mogą różnicować się w komórki Th17 lub TReg (między innymi), z których oba kierują odpowiedzią układu odpornościowego na różne sposoby. Komórki Th17 stymulują silną odpowiedź zapalną, podczas gdy komórki TReg stymulują efekt odwrotny. Te pierwsze polegają na znacznie większym stopniu glikolizy , ze względu na zwiększone zapotrzebowanie na energię.
Aby sprofilować zawartość metaboliczną komórki, naukowcy muszą zidentyfikować komórkę będącą przedmiotem zainteresowania w większej populacji, wyizolować ją do analizy, szybko zahamować enzymy i zatrzymać procesy metaboliczne w komórce, a następnie zastosować techniki takie jak NMR , spec , mikroprzepływy i inne metody analizy zawartości komórki.
Zmienność proteomu
Podobnie jak w przypadku zmienności w metabolomie, białka obecne w komórce i ich obfitość mogą różnić się w zależności od komórki w podobnej populacji. Podczas gdy transkrypcja i translacja determinują ilość i różnorodność wytwarzanych białek, procesy te są nieprecyzyjne, a komórki mają szereg mechanizmów, które mogą zmieniać lub degradować białka, co pozwala na zmienność proteomu, której nie można wytłumaczyć zmiennością ekspresji genów. Białka mają również wiele innych ważnych cech oprócz tego, że są obecne lub nieobecne, na przykład czy zostały poddane modyfikacje potranslacyjne , takie jak fosforylacja , lub są związane z cząsteczkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Zróżnicowanie w obfitości i charakterystyce białek ma implikacje dla takich dziedzin, jak badania nad rakiem i terapia przeciwnowotworowa, gdzie lek ukierunkowany na określone białko może mieć różny wpływ ze względu na zmienność proteomu lub różnić się skutecznością ze względu na szersze zjawisko biologiczne niejednorodność guza .
Cytometria, metody powierzchniowe i technologie mikroprzepływowe to trzy klasy narzędzi powszechnie stosowanych do profilowania proteomów poszczególnych komórek. Cytometria pozwala naukowcom wyizolować interesujące komórki i wybarwić 15–30 białek, aby zmierzyć ich lokalizację i / lub względną obfitość. Techniki cyklu obrazowania zostały opracowane w celu pomiaru liczebności i dystrybucji wielu celów w próbkach biopsyjnych i tkankach. W tych metodach 3–4 cele są barwione przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie, obrazowane , a następnie pozbawiono ich fluoroforów różnymi sposobami, w tym chemią opartą na utlenianiu lub ostatnio metodami koniugacji przeciwciało-DNA, umożliwiając wybarwienie dodatkowych celów w kolejnych cyklach; w niektórych metodach zwizualizowano do 60 pojedynczych celów. W przypadku metod powierzchniowych naukowcy umieszczają pojedynczą komórkę na powierzchni pokrytej przeciwciałami, które następnie wiążą się z białkami wydzielanymi przez komórkę i umożliwiają ich pomiar. Metody mikroprzepływowe do analizy proteomu unieruchamiają pojedyncze komórki na mikroczipie i wykorzystują barwienie do pomiaru białek będących przedmiotem zainteresowania lub przeciwciał do wiązania się z białkami będącymi przedmiotem zainteresowania.
Różnice w wielkości i morfologii komórek
Komórki w skądinąd podobnej populacji mogą różnić się wielkością i morfologią ze względu na różnice w funkcji, zmiany w metabolizmie lub po prostu znajdowanie się w różnych fazach cyklu komórkowego lub z powodu innego czynnika. Na przykład komórki macierzyste mogą dzielić się asymetrycznie, co oznacza, że dwie wynikowe komórki potomne mogą mieć różne przeznaczenie (wyspecjalizowane funkcje) i mogą różnić się od siebie rozmiarem lub kształtem. Naukowcy badający rozwój mogą być zainteresowani śledzeniem cech fizycznych poszczególnych potomków w rosnącej populacji, aby zrozumieć, w jaki sposób komórki macierzyste różnicują się w złożoną tkankę lub organizm w czasie.
Mikroskopię można wykorzystać do analizy wielkości i morfologii komórek, uzyskując wysokiej jakości obrazy w czasie. Obrazy te zazwyczaj zawierają populację komórek, ale można zastosować algorytmy do identyfikacji i śledzenia poszczególnych komórek na wielu obrazach. Algorytmy muszą być w stanie przetworzyć gigabajty danych, aby usunąć szum i podsumować istotne cechy dla danego pytania badawczego.
Zmienność cyklu komórkowego
Poszczególne komórki w populacji często znajdują się w różnych punktach cyklu komórkowego. Naukowcy, którzy chcą zrozumieć cechy komórki w określonym punkcie cyklu, mieliby trudności z wykorzystaniem szacunków na poziomie populacji, ponieważ uśredniliby pomiary z komórek na różnych etapach. Również zrozumienie cyklu komórkowego w poszczególnych chorych komórkach, takich jak te w guzie, jest również ważne, ponieważ często mają one zupełnie inny cykl niż zdrowe komórki. Analiza charakterystyki cyklu komórkowego pojedynczej komórki pozwala naukowcom bardziej szczegółowo zrozumieć te właściwości.
Zmienność cyklu komórkowego można badać za pomocą kilku opisanych wcześniej metod. Na przykład komórki w G2 będą dość duże (ponieważ znajdują się dokładnie w punkcie, w którym mają się podzielić na dwie części) i można je zidentyfikować za pomocą protokołów dotyczących rozmiaru i kształtu komórki. Komórki w fazie S kopiują swoje genomy i można je zidentyfikować za pomocą protokołów barwienia DNA i pomiaru jego zawartości za pomocą cytometrii przepływowej lub ilościowej mikroskopii fluorescencyjnej lub za pomocą sond dla genów o wysokiej ekspresji w określonych fazach cyklu komórkowego.