polimeraza RNA IV
Polimeraza RNA IV ( RNAP IV ) jest enzymem syntetyzującym małe interferujące RNA (siRNA) w roślinach, które wyciszają ekspresję genów . RNAP IV należy do rodziny enzymów katalizujących proces transkrypcji znanych jako polimerazy RNA , które syntetyzują RNA z matryc DNA. Uważa się, że geny RNAP IV, odkryte w filogenetycznych roślin lądowych, powstały w wyniku wieloetapowych procesów ewolucyjnych zachodzących w polimerazie RNA II filogenezy. Za takim szlakiem ewolucyjnym przemawia fakt, że RNAP IV składa się z 12 podjednostek białkowych, które są podobne lub identyczne z polimerazą RNA II i są specyficzne dla genomów roślin. Poprzez syntezę siRNA, RNAP IV bierze udział w regulacji heterochromatyny w procesie znanym jako metylacja DNA kierowana przez RNA (RdDM).
Odkrycie
Studia filogenetyczne
Badania filogenetyczne roślin lądowych doprowadziły do odkrycia polimerazy RNA IV. Analiza największej ( RPD1 ) i drugiej co do wielkości podjednostki ( RPD2 ) RNAP IV była analogiczna do przeszukiwania genów RNAP II metodą Blast . Geny dla RPD1 i RPD2 znaleziono we wszystkich roślinach lądowych, a największy gen znaleziono w taksonie alg, Charale . Dalsza analiza pochodzenia białka wskazuje na zdarzenie duplikacji genu największej podjednostki, co sugeruje, że zdarzenie duplikacji nastąpiło po rozbieżności Charales i roślin lądowych i alg. Konkretnie, największa podjednostka w RNAP II utworzyła RPD1 w wyniku duplikacji, a gen RPD2 powstał w wyniku rozbieżności. Dowody na te duplikacje sugerują, że geny RNAP IV pochodzą z filogenezy RNAP II w procesie wieloetapowym. Innymi słowy, dywergencja pierwszej podjednostki jest pierwszym z wielu etapów ewolucji nowych RNAP. RNAP IV ma również wiele podjednostek z RNAP II, oprócz największej i drugiej co do wielkości podjednostki, co sugerowały również ciągłe zdarzenia duplikacji poszczególnych linii.
Rozróżnienie między RNAP IV i RNAP V
Arabidopsis wyraża dwie formy RNAP IV, wcześniej określane jako RNAP IVa i RNAP IVb, które różnią się największą podjednostką i nie mają zbędnych działań. Skuteczne wyciszanie transpozonów wymaga obu form RNAP IV, podczas gdy do podstawowego wyciszania wymagany jest tylko RNAP IVa. Odkrycie to sugerowało wymóg obu form dla mechanizmu metylacji transpozonu. Późniejsze eksperymenty wykazały, że to, co kiedyś uważano za dwie formy RNAP IV, to w rzeczywistości dwie strukturalnie i funkcjonalnie odrębne polimerazy. RNAP IVa został określony jako RNAP IV, podczas gdy RNAP IVb stał się znany jako RNAP V.
Struktura
Polimeraza RNA IV składa się z 12 podjednostek białkowych, które są podobne lub identyczne z 12 podjednostkami tworzącymi polimerazę RNA II . Tylko cztery podjednostki odróżniają strukturę RNAP IV od RNAP II i RNAP V. Polimeraza RNA V różni się od RNAP II sześcioma podjednostkami, co wskazuje, że zarówno RNAP IV, jak i RNAP V wyewoluowały z RNAP II w roślinach. W Arabidopsis stwierdzono, że dwa unikalne geny kodują podjednostki, które odróżniają RNAP IV od RNAP II. Największa podjednostka jest kodowana przez NRPD1 (dawniej NRPD1a), podczas gdy druga co do wielkości podjednostka jest kodowana przez NRPD2 i jest wspólna z RNAP V. Podjednostki te zawierają domeny karboksylowo-końcowe (CTD), które są niezbędne do produkcji 20-30% siRNA wytwarzanych przez polimerazę RNA IV, ale nie są wymagane do metylacji DNA .
Funkcjonować
Istnieją dowody na to, że polimeraza RNA IV (RNAP IV) jest odpowiedzialna za wytwarzanie heterochromatyny , ponieważ dysfunkcja jednej z podjednostek katalitycznych RNAP IV (NRPD1 i NRPD2) zakłóca tworzenie heterochromatyny. Ponieważ heterochromatyna jest wyciszoną częścią DNA, powstaje, gdy RNAP IV wzmacnia produkcję małych interferujących RNA (siRNA), które są odpowiedzialne za metylację zasad cytozynowych w DNA; ta metylacja wycisza segmenty kodu genetycznego, które nadal mogą być transkrybowane na mRNA, ale nie ulegają translacji na białka. RNAP IV bierze udział w ustalaniu wzorców metylacji w genach 5S podczas dojrzewania roślin, co skutkuje rozwojem cech dorosłych roślin.
Mechanizm
W pierwszym etapie tworzenia heterochromatyny, RNAP IV łączy się z zależną od RNA polimerazą RNA znaną jako RDR2, tworząc dwuniciowy prekursor siRNA. Następnie DICER-Like Protein 3 (DLP3), enzym, który tnie substraty dwuniciowego RNA, rozszczepia dwuniciowy prekursor na siRNA, z których każdy ma długość 24 nukleotydów. Te siRNA są następnie metylowane na swoich końcach 3' przez białko znane jako HUA ENHANCER 1 (HEN1). Wreszcie, te metylowane siRNA łączą się z białkiem znanym jako ARGONAUTE-4 (AGO4) w celu utworzenia kompleksu wyciszającego, który może przeprowadzić wymaganą metylację do produkcji heterochromatyny. Proces ten jest określany jako metylacja DNA kierowana przez RNA (RdDM) lub wyciszanie za pośrednictwem Pol IV, ponieważ wprowadzenie tych grup metylowych przez siRNA wycisza zarówno transpozony , jak i powtarzające się sekwencje DNA.
Rozporządzenie
SAWADEE HOMEODOMAIN HOMOLOG 1 (SHH1) to białko, które oddziałuje z RNAP IV i ma kluczowe znaczenie w jego regulacji poprzez metylację . SHH1 może wiązać się z chromatyną tylko w określonych „zaznaczonych” segmentach, ponieważ jego domena „SAWADEE” jest domeną wiążącą chromatynę, która sonduje niemetylowane modyfikacje K4 i metylowane K9 na ogonie histonu 3 (H3) chromatyny; jego kieszenie wiążące przyczepiają się następnie do chromatyny w tych miejscach i umożliwiają zajęcie RNAP IV w tych samych loci. W ten sposób SHH1 działa, aby umożliwić rekrutację i stabilność RNAP IV w najbardziej aktywnie ukierunkowanych loci genomowych RdDM w celu promowania wspomnianej wcześniej biogenezy siRNA siRNA o długości 24 nukleotydów. Ponadto wiąże się z represyjnymi modyfikacjami histonów, a wszelkie mutacje, które zakłócają ten proces, wiążą się ze zmniejszeniem metylacji DNA i produkcji siRNA. Regulacja produkcji siRNA przez RNAP IV za pośrednictwem tego mechanizmu skutkuje poważnymi efektami w dół, ponieważ siRNA wytwarzane w ten sposób chronią genom przed proliferacją inwazyjnych wirusów i endogennych elementów transpozycyjnych.