Analiza wartości Phi

Analiza wartości Phi , $analiza$ lub $wartości -$ techniką jest eksperymentalną inżynierii białek do badania struktury pofałdowanego stanu przejściowego małych domen białkowych , które składają się stan dwustanowy sposób. Strukturę złożonego stanu przejściowego trudno jest znaleźć metodami takimi jak białkowy NMR lub krystalografia rentgenowska ponieważ składane stany przejściowe są z definicji ruchome i częściowo nieustrukturyzowane. W analizie wartości $kinetykę$ i stabilność konformacyjną fałdowania białka typu dzikiego porównuje się z mutantami punktowymi , aby znaleźć wartości phi . Mierzą one udział energetyczny zmutowanej reszty w fałdowanym stanie przejściowym, który ujawnia stopień natywnej struktury wokół zmutowanej reszty w stanie przejściowym, uwzględniając względne energie swobodne stanu niezłożonego, stanu złożonego i stanu przejściowego dla białek typu dzikiego i zmutowanych.

Reszty białka są mutowane jedna po drugiej, aby zidentyfikować skupiska reszt, które są dobrze uporządkowane w złożonym stanie przejściowym. Interakcje tych reszt można sprawdzić za pomocą analizy $podwójnego$ mutanta , w której efekty mutantów w jednym miejscu porównuje się z efektami mutantów podwójnych. Większość mutacji jest konserwatywna i zastępuje pierwotną resztę mniejszą ( mutacje tworzące jamy ), jak alanina , chociaż tyrozyna -do- fenyloalaniny , izoleucyna do- można również zastosować mutanty waliny i treoniny z seryną . Inhibitor chymotrypsyny , $domena$ SH3 , WW , poszczególne domeny białek L i G, ubikwityna i barnaza zostały zbadane za pomocą analizy.

Podejście matematyczne

Wykresy energetyczne dla

lewej

) lub 1 (po prawej). D jest energią stanu zdenaturowanego, sztyletem stanu przejściowego, a N energią stanu natywnego.

Phi definiuje się w następujący sposób:

{\ Displaystyle \ phi = {\ Frac {(\ Delta G_ {W} ^ {TS \ strzałka w prawo D} - \ Delta G_ {M} ^ {TS \ strzałka w prawo D})} {(\ Delta G_ {W} ^ {N \ strzałka w prawo D} - \ Delta G_ {M} ^ {N \ strzałka w prawo D})}} = {\ Frac {\ Delta \ Delta G ^ {TS \ strzałka w prawo D}} {\ Del ta \Delta G^{N\rightarrow D}}}}

$}} to różnica energii między stanem$ $re {\ Displaystyle \ Delta G_ {M} ^ {TS \ rightarrow D}}$ przejściowym ${\ displaystyle \ Delta G ^ {N \ strzałka w prawo D}}$ zdenaturowanym białka typu dzikiego , to ta sama różnica energii, ale dla zmutowanego białka, a bity to różnice w energii między stanem natywnym a zdenaturowanym. Wartość phi jest interpretowana jako stopień, w jakim mutacja destabilizuje stan przejściowy w stosunku do stanu złożonego.

Chociaż $.$ mieć zakres od zera do jednego, mogą pojawić się wartości ujemne Wartość zero sugeruje, że mutacja nie wpływa na strukturę stanu przejściowego ograniczającego szybkość fałdowania, a wartość jeden sugeruje, że mutacja destabilizuje stan przejściowy w takim samym stopniu, jak stan pofałdowany; wartości bliskie zeru sugerują, że obszar wokół mutacji jest względnie rozwinięty lub nieustrukturyzowany w stanie przejściowym, a wartości bliskie jedności sugerują, że lokalna struktura stanu przejściowego w pobliżu miejsca mutacji jest podobna do stanu natywnego. Konserwatywne podstawienia na powierzchni białka często dają wartości phi bliskie jedności. Gdy ${\ displaystyle \ phi}$ jest dobrze między zerem a jedynką, jest mniej pouczające, ponieważ nie mówi nam, o co chodzi: ϕ {\ displaystyle \ phi}

Sam stan przejściowy jest częściowo ustrukturyzowany; Lub
Istnieją dwie populacje białek o prawie równej liczbie, jeden rodzaj, który jest w większości niesfałdowany, a drugi, który jest w większości sfałdowany.

Kluczowe założenia

Analiza wartości Phi zakłada postulat Hammonda , który mówi, że energia i struktura chemiczna są ze sobą skorelowane. Chociaż związek między złożonymi strukturami stanu pośredniego i natywnego może korelować między ich energiami, gdy krajobraz energetyczny ma dobrze zdefiniowane, głębokie globalne minimum, destabilizacje energii swobodnej mogą nie dawać użytecznych informacji strukturalnych, gdy krajobraz energetyczny jest bardziej płaski lub ma wiele lokalnych minimów.
Analiza wartości Phi zakłada, że ścieżka fałdowania nie jest znacząco zmieniona, chociaż energia fałdowania może być. Ponieważ mutacje niezachowawcze mogą tego nie potwierdzać, preferowane są substytucje konserwatywne, chociaż mogą dawać mniejsze destabilizacje energetyczne, które są trudniejsze do wykrycia.
Ograniczenie do liczb większych od $zera$ jest równoznaczne z założeniem, że mutacja zwiększa stabilność i nie obniża energii ani stanu natywnego, ani przejściowego W tej samej linii zakłada się, że interakcje, które stabilizują stan przejściowy fałdowania, są podobne do tych w strukturze natywnej, chociaż niektóre badania fałdowania białek wykazały, że stabilizowanie interakcji nienatywnych w stanie przejściowym ułatwia fałdowanie.

Przykład: barnaza

Alan Fersht był pionierem analizy wartości phi w swoich badaniach barnazy białka małych bakterii . Korzystając z dynamiki molekularnej , odkrył, że stan przejściowy między zwijaniem a rozwijaniem wygląda jak stan natywny i jest taki sam bez względu na kierunek reakcji. Phi różniło się w zależności od lokalizacji mutacji, ponieważ niektóre regiony dawały wartości bliskie zeru, a inne bliskie jedności. Dystrybucja ${\ Displaystyle \ phi}$ wartości w całej sekwencji białka zgadzały się z całym symulowanym stanem przejściowym z wyjątkiem jednej helisy, która składała się częściowo niezależnie i tworzyła natywne kontakty z resztą białka dopiero po całkowitym uformowaniu się stanu przejściowego. Taka zmienność szybkości $wartości,$ w jednym białku utrudnia interpretację ponieważ w przeciwnym razie strukturę stanu przejściowego należy porównać z symulacjami składania-rozwijania, które są kosztowne obliczeniowo.

Warianty

Niedawno pojawiły się inne techniki „zaburzeń kinetycznych” do badania stanu przejściowego fałdowania. Najbardziej znana jest wartość psi ( $,$ którą można znaleźć przez inżynierię dwóch reszt aminokwasowych wiążących metal, takich jak histydyna , w białku, a następnie rejestrację kinetyki fałdowania jako funkcji stężenia jonów metali, chociaż Fersht pomyślał, że to podejście trudne. Wariant „ sieciowania ” ${\ Displaystyle \ phi}$ -wartość została wykorzystana do badania asocjacji segmentów w fałdowanym stanie przejściowym, gdy wprowadzono kowalencyjne wiązania poprzeczne, takie jak wiązania dwusiarczkowe . ${\ Displaystyle \ phi}$ $Analiza$ wartości -T została wykorzystana jako rozszerzenie -wartości do pomiaru odpowiedzi mutantów w funkcji temperatury w celu oddzielenia wkładów entalpicznych i entropicznych w stan przejściowy wolny energia.

Ograniczenia

Błąd w pomiarach stabilności równowagi i szybkości (nie) fałdowania w wodzie może być duży, gdy wartości roztworów $denaturantami$ muszą być ekstrapolowane do prawie czystych roztworów wodnych lub różnicy stabilności między białkiem natywnym a zmutowanym jest „niski” lub mniejszy niż 7 kJ/mol. Może to spowodować, $.$ wypadnie poza zakres zero-jedynkowy Obliczone wartości ${\ Displaystyle \ phi}$ silnie zależą od liczby dostępnych punktów danych. Badanie 78 mutantów domeny WW z maksymalnie czterema mutacjami na resztę określiło ilościowo, jakie typy mutacji unikają interferencji ze strony elastyczności stanu natywnego, solwatacji i innych efektów, a analiza statystyczna pokazuje, że wiarygodne informacje o zaburzeniach stanu przejściowego można uzyskać z dużych ekrany mutantów.

Zobacz też