Identyfikacja metylotransferazy adeninowej DNA
Identyfikacja metylotransferazy DNA adeninowej , często w skrócie DamID , jest protokołem biologii molekularnej używanym do mapowania miejsc wiązania białek wiążących DNA i chromatynę u eukariontów . DamID identyfikuje miejsca wiązania poprzez ekspresję proponowanego białka wiążącego DNA jako białka fuzyjnego z metylotransferazą DNA . Wiązanie białka będącego przedmiotem zainteresowania z DNA lokalizuje metylotransferazę w regionie miejsca wiązania. adeniny nie występuje naturalnie u eukariontów, dlatego można stwierdzić, że metylacja adeniny w jakimkolwiek regionie została spowodowana przez białko fuzyjne, co sugeruje, że region znajduje się w pobliżu miejsca wiązania. DamID to metoda alternatywna dla ChIP-on-chip lub ChIP-seq .
Opis
Zasada
N6-metyladenina (m6A) jest produktem addycji grupy metylowej (CH 3 ) w pozycji 6 adeniny. Ten zmodyfikowany nukleotyd jest nieobecny u zdecydowanej większości eukariontów, z wyjątkiem C. elegans , ale jest szeroko rozpowszechniony w genomach bakteryjnych jako część systemów modyfikacji restrykcyjnej lub naprawy DNA . U Escherichia coli metylacja adeniny jest katalizowana przez metylotransferazę adeniny Dam (DNA metylotransferaza adeniny), która katalizuje metylację adeniny wyłącznie w palindromowej sekwencji GATC. Ektopowa ekspresja Dam w komórkach eukariotycznych prowadzi do metylacji adeniny w sekwencjach GATC bez żadnych innych zauważalnych skutków ubocznych.
Na tej podstawie DamID polega na fuzji Dam z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania (zwykle białkiem, które oddziałuje z DNA, takim jak czynniki transkrypcyjne ) lub składnikiem chromatyny. Białko będące przedmiotem zainteresowania kieruje zatem Dam do jego pokrewnego in vivo , powodując metylację sąsiednich GATC. Obecność m6A, pokrywająca się z miejscami wiązania białek będących przedmiotem zainteresowania, jest wykazywana metodą PCR metylu .
PCR metylu
W tym teście genom jest trawiony przez DpnI , który tnie tylko metylowane GATC. Dwuniciowe adaptery o znanej sekwencji są następnie łączone z końcami generowanymi przez DpnI. Produkty ligacji są następnie trawione przez Dpnll . Enzym ten tnie niemetylowane GATC, zapewniając amplifikację tylko fragmentów flankowanych przez kolejne metylowane GATC w kolejnej reakcji PCR. Następnie przeprowadza się PCR ze starterami pasującymi do adapterów, co prowadzi do specyficznej amplifikacji fragmentów genomowych flankowanych przez metylowane GATC.
Specyfika DamID w porównaniu z immunoprecypitacją chromatyny
Chromatyna Immuno-Precypitacja lub (ChIP) jest alternatywną metodą oznaczania wiązania białek w określonych loci genomu. W przeciwieństwie do ChIP, DamID nie wymaga specyficznego przeciwciała przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania. Z jednej strony pozwala to na mapowanie białek, dla których takie przeciwciało nie jest dostępne. Z drugiej strony uniemożliwia to specyficzne mapowanie zmodyfikowanych potranslacyjnie .
w danym momencie znajduje się białko będące przedmiotem zainteresowania , podczas gdy testy DamID określają, gdzie się znajdowało . Powodem jest to, że m6A pozostaje w DNA po odejściu białka fuzyjnego Dam. W przypadku białek, które są związane lub niezwiązane w swoich miejscach docelowych, nie zmienia to ogólnego obrazu. Może to jednak prowadzić do silnych różnic w przypadku białek ślizgających się po DNA ( np. polimeraza RNA).
Znane uprzedzenia i problemy techniczne
Błąd metylacji plazmidu
W zależności od sposobu przeprowadzenia eksperymentu, DamID może podlegać tendencji do metylacji plazmidu. Ponieważ plazmidy są zwykle amplifikowane w E. coli , gdzie Dam jest naturalnie eksprymowany, są one metylowane na każdym GATC. W eksperymentach z przejściową transfekcją DNA tych plazmidów jest odzyskiwane wraz z DNA transfekowanych komórek, co oznacza, że fragmenty plazmidu są amplifikowane w metylowej reakcji PCR. Każda sekwencja genomu, która wykazuje homologię lub identyczność z plazmidem, może zatem wydawać się związana z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. W szczególności dotyczy to otwartej ramki odczytu białka będącego przedmiotem zainteresowania, które jest obecne zarówno w plazmidzie, jak iw genomie. W z mikromacierzami to odchylenie można wykorzystać do zapewnienia hybrydyzacji odpowiedniego materiału. W stabilnych liniach komórkowych lub w pełni transgenicznych zwierzętach nie obserwuje się tego błędu, ponieważ nie odzyskuje się plazmidowego DNA.
apoptoza
Komórki apoptotyczne degradują swoje DNA w charakterystyczny wzór drabiny nukleosomów. Generuje to fragmenty DNA, które można zligować i zamplifikować podczas procedury DamID (laboratorium van Steensel, obserwacje niepublikowane). Wpływ tych fragmentów nukleosomów na profil wiązania białka nie jest znany.
Rezolucja
Rozdzielczość DamID jest funkcją dostępności sekwencji GATC w genomie. Białko można zmapować tylko w dwóch kolejnych miejscach GATC. Mediana odstępów między fragmentami GATC wynosi 205 pz u Drosophila (FlyBase wydanie 5), 260 u myszy (Mm9) i 460 u człowieka (HG19). Zmodyfikowany protokół (DamIP), który łączy immunoprecypitację m6A z wariantem Dam z mniej specyficznym rozpoznawaniem miejsca docelowego, może być zastosowany do uzyskania danych o wyższej rozdzielczości.
Metody specyficzne dla typu komórki
Główną zaletą DamID w porównaniu z ChIP seq jest to, że profilowanie miejsc wiązania białek można testować w określonym typie komórek in vivo bez konieczności fizycznego rozdzielania subpopulacji komórek. Pozwala to na badanie procesów rozwojowych lub fizjologicznych w modelach zwierzęcych.
Ukierunkowany DamID
Podejście ukierunkowane na DamID (TaDa) wykorzystuje zjawisko reinicjacji rybosomów do ekspresji białek fuzyjnych Dam na odpowiednio niskich poziomach dla DamID (tj. Dam nie nasyca, co pozwala uniknąć toksyczności). Ten konstrukt można łączyć z promotorami specyficznymi dla typu komórkowego, co skutkuje metylacją specyficzną dla tkanki. Podejście to można wykorzystać do oznaczenia wiązania czynnika transkrypcyjnego w komórce typu będącego przedmiotem zainteresowania lub alternatywnie dam można połączyć z Pol II w celu określenia wiązania polimerazy RNA, a tym samym wywnioskować ekspresję genów specyficzną dla komórki. Ukierunkowany DamID wykazano w Drosophila i mysich.
ID DamID wyjścia FRT/FLP
Specyficzny dla komórki DamID można również uzyskać za pomocą wycięcia za pośrednictwem rekombinacji kasety terminatora transkrypcji przed białkiem fuzyjnym Dam. Kaseta terminatora jest otoczona miejscami rekombinacji FRT, które można usunąć w połączeniu ze specyficzną tkankowo ekspresją rekombinazy FLP . Po usunięciu kasety, fuzja Dam ulega ekspresji na niskim poziomie pod kontrolą podstawowego promotora.
Warianty
Oprócz wykrywania standardowych interakcji białko-DNA, DamID można wykorzystać do badania innych aspektów biologii chromatyny.
Split DamID
Metodę tę można wykorzystać do wykrycia współwiązania dwóch czynników z tym samym locus genomowym . Metylaza Dam może ulegać ekspresji w dwóch połówkach, które są połączone z różnymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Kiedy oba białka wiążą się z tym samym regionem DNA, enzym Dam jest rekonstytuowany i jest w stanie metylować otaczające miejsca GATC.
Dostępność chromatyny
Ze względu na wysoką aktywność enzymu, ekspresja untethered Dam powoduje metylację wszystkich regionów dostępnej chromatyny. Podejście to można zastosować jako alternatywę dla ATAC-seq lub DNAse-seq . W połączeniu z metodami DamID specyficznymi dla typu komórki, ekspresja niezwiązanej Dam może być wykorzystana do identyfikacji regionów promotora lub wzmacniacza specyficznych dla typu komórki.
Oddziaływania RNA-DNA
Wariant DamID znany jako RNA-DamID może być użyty do wykrywania interakcji między cząsteczkami RNA i DNA. Ta metoda opiera się na ekspresji białka fuzyjnego Dam-MCP, które jest zdolne do wiązania się z RNA zmodyfikowanym pętlami macierzystymi MS2 . Wiązanie białka fuzyjnego Dam z RNA skutkuje wykrywalną metylacją w miejscach wiązania RNA z genomem.
Długofalowe interakcje regulacyjne
Sekwencje DNA oddalone od miejsca wiązania białka można zbliżyć fizycznie poprzez zapętlenie chromosomów. Na przykład, takie interakcje pośredniczą w wzmacniacza i promotora . Te interakcje można wykryć poprzez działanie metylacji Dam. Jeśli Dam jest ukierunkowany na określone znane locus DNA, dystalne miejsca zbliżone do siebie ze względu na konfigurację 3D DNA również będą metylowane i można je wykryć tak, jak w konwencjonalnym DamID.
DamID pojedynczej komórki
DamID jest zwykle wykonywany na około 10 000 komórek (chociaż wykazano to przy mniejszej liczbie). Oznacza to, że uzyskane dane reprezentują średnie wiązanie lub prawdopodobieństwo wystąpienia zdarzenia wiązania w tej populacji komórek. Protokół DamID dla pojedynczych komórek został również opracowany i zastosowany do komórek ludzkich. Podejścia oparte na pojedynczych komórkach mogą uwypuklić heterogeniczność powiązań chromatyny między komórkami.
Dalsza lektura
- Vogel MJ, Peric-Hupkes D, van Steensel B (2007). „Wykrywanie interakcji białko-DNA in vivo przy użyciu DamID w komórkach ssaków” . Protokoły natury . 2 (6): 1467–78. doi : 10.1038/nprot.2007.148 . PMC 7032955 . PMID 17545983 .
- Greil F, Moorman C, van Steensel B (2006). DamID: mapowanie interakcji białko-genom in vivo przy użyciu metylotransferazy adeninowej związanego DNA . Metody w enzymologii . Tom. 410. s. 342–59. doi : 10.1016/S0076-6879(06)10016-6 . ISBN 9780121828158 . PMID 16938559 .
- Germann S, Juul-Jensen T, Letarnec B, Gaudin V (październik 2006). „DamID, nowe narzędzie do badania profilowania chromatyny roślinnej in vivo i jego zastosowanie do identyfikacji domniemanych docelowych loci LHP1” . Dziennik roślin . 48 (1): 153–63. doi : 10.1111/j.1365-313X.2006.02859.x . PMID 16972870 .