Dekarboksylaza kwasu ferulowego
| AnFDC1 | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 Dimer Fdc1 z Aspergillus niger . Plik PDB:
| |||||||||
| identyfikatory 4ZA4 | |||||||||
| nr WE | 4.1.1.102 | ||||||||
| Bazy danych | |||||||||
| IntEnz | Widok IntEnz | ||||||||
| BRENDA | Wpis BRENDY | ||||||||
| ExPASy | Widok NiceZyme | ||||||||
| KEGG | Wpis KEGG | ||||||||
| MetaCyc | szlak metaboliczny | ||||||||
| PRYM | profil | ||||||||
| Struktury PDB | RCSB PDB PDBe PDB suma | ||||||||
| |||||||||
Dekarboksylazy kwasu ferulowego (Fdc) są enzymami dekarboksylazy zdolnymi do odwracalnej dekarboksylacji aromatycznych kwasów karboksylowych, takich jak kwas ferulowy i kwas cynamonowy . Fdc to grzybowe homologi enzymu UbiD z E. coli , który bierze udział w biosyntezie ubichinonu. To umieszcza Fdc w szerszej rodzinie enzymów UbiD, reprezentującej odrębny klad w rodzinie. Wykazano, że obecność fdc1 i powiązanych genów pad1 (Pad1 homologiczny do UbiX w E.coli ) jest wymagana do dekarboksylacji kwasów fenyloakrylowych w Saccharomyces cerevisiae .
W 2015 roku kofaktor prFMN został odkryty w miejscu aktywnym Fdc1 z Aspergillus niger (AnFdc) za pomocą krystalografii , zanim te badania genetyczne doprowadziły do przypuszczenia, że zarówno UbiD, jak i UbiX kodują izofunkcyjne dekarboksylazy. W rzeczywistości stwierdzono, że UbiX/Pad to flawinowe dostarczające kofaktor prFMN do UbiD/Fdc, gdzie jest on wykorzystywany do odwracalnej dekarboksylacji substratów alfa-beta nienasyconych kwasów karboksylowych. Od czasu odkrycia prFMN AnFDC stał się najlepiej poznanym przedstawicielem rodziny enzymów UbiD
Mechanizm AnFDC
W tej samej pracy, w której wydedukowano strukturę prFMN w miejscu aktywnym AnFdc1, zaproponowano mechanizm, dzięki któremu Fdc1 dekarboksyluje α,β-nienasycone kwasy karboksylowe. Nie wszystkie enzymy UbiD dekarboksylują kwasu akrylowego i inne mechanizmy mogą odgrywać rolę w przypadku alternatywnych substratów. W przypadku AnFdc1 zauważono, że prFMN wykazuje charakterystykę ylidu azometinowego C4a-N5+=C1' (ryc. 1). Jest to dobrze znany 1,3-dipol , umieszczony w miejscu aktywnym enzymu w pobliżu substratu α,β-nienasyconego kwasu karboksylowego, który zawiera 1,3-dipolarofil. W związku z tym zaproponowano, że za enzymatyczną dekarboksylację odpowiada mechanizm 1,3-dipolarnej cykloaddycji . Zostało to potwierdzone w późniejszym artykule.
Mechanizm proponowany dla 1,3-dipolarnej cykloaddycji przez Fdc1 jest następujący (związki pośrednie przedstawione na rysunku 1):
- 1,3-dipolarna cykloaddycja między prFMN iminem a α,β-nienasyconym substratem prowadzi do cykloadduktu pirolidyny ( Int1 )
- Ten cykloaddukt pirolidyny obsługuje jednoczesną dekarboksylację i otwarcie pierścienia, co prowadzi do powstania odrębnego adduktu prFMN-alkenu ( Int2 )
- Konserwatywna reszta kwasu glutaminowego (E282) przekazuje proton ugrupowaniu alkenu , w wyniku czego powstaje drugi cykloaddukt pirolidyny ( Int3 )
- Reakcja kończy się cykliczną eliminacją Int3 i uwolnieniem produktu alkenowego i CO2
W badaniu przedstawiono dowody na 1,3-dipolarną cykloaddycję, z powodu podejrzenia obrotu kwasu cynamonowego, struktura krystaliczna AnFdc1 w kompleksie z kwasem α-fluorocynamonowym ujawniła, że podstawowe węgle Cα i Cβ znajdują się bezpośrednio nad prFMN iminium C1 odpowiednio ' i C4a (pokazane jako Sub na rycinie 1 - z kwasem cynamonowym w przeciwieństwie do kwasu α-fluorocynamonowego). Potwierdzono, że kwas cynamonowy wiąże się w podobny sposób, stosując nieaktywne kryształy AnFdc1 zawierające FMN. Mutant AnFdc1 E282Q skrystalizowany z kwasem cynamonowym ujawnił strukturę odpowiadającą formom Int2 , co oznaczało, że postęp w cyklu 1,3-dipolarnej cykloaddycji został zatrzymany, ponieważ E282 nie jest w stanie przekazać protonu ugrupowaniu alkenu.
Do obserwacji struktur Int1 i Int3 zastosowano analogi alkinów . Podobnie jak alkeny związki te mogą również działać jako dipolarofile, ale cykloaddycja dawałaby cykloaddukt zawierający wiązanie podwójne. Nieaktywny enzym AnFdc1 (ze związanym rodnikiem prFMN ) współkrystalizowany z kwasem fenylopropionowym wykazywał wiązanie w podobny sposób jak kwas α-fluorocynamonowy AnFdc1 i kwas cynamonowy AnFdc1 ze związanym FMN ( Inhib ). Aktywny enzym AnFdc1 współkrystalizowany z kwasem fenylopropionowym wykazał wyraźną gęstość dla cykloadduktu 3-piroliny ( Int3' ) pomiędzy alkinem i prFMN iminem . Int3' reprezentuje strukturę po dekarboksylacji, więc przyjęto, że w czasie potrzebnym do krystalizacji (~24h) nastąpiła dekarboksylacja. Stosując procedurę szybkiego namaczania, zaobserwowano inny cykloaddukt, który zachował ugrupowanie karboksylowe ( Int1' ).