Prenylotransferaza flawinowa (UbiX)
| prenylotransferaza flawinowa | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 prenylotransferaza flawinowa homododekamer, Pseudomonas aeruginosa
| |||||||||
| Identyfikatory | |||||||||
| nr WE | 2.5.1.129 | ||||||||
| Bazy danych | |||||||||
| IntEnz | Widok IntEnz | ||||||||
| BRENDA | Wpis BRENDY | ||||||||
| ExPASy | Widok NiceZyme | ||||||||
| KEGG | Wpis KEGG | ||||||||
| MetaCyc | szlak metaboliczny | ||||||||
| PRYM | profil | ||||||||
| Struktury PDB | RCSB PDB PDBe PDB suma | ||||||||
| |||||||||
UbiX jest prenylotransferazą flawinową , katalizującą dodanie dimetyloallilo-monofosforanu (DMAP) (lub dimetyloallilo-pirofosforanu (DMAPP)) na pozycje N5 i C6 FMN , czego kulminacją jest utworzenie prenylowanego kofaktora FMN ( prFMN ) . Enzym bierze udział w szlaku biosyntezy ubichinonu w E. coli , skąd bierze swoją nazwę UbiX jest związany z enzymami UbiD , ponieważ prFMN jest wykorzystywany przez enzymy UbiD w ich funkcji jako odwracalne dekarboksylazy. Co niezwykłe dla prenylotransferazy, UbiX nie jest zależny od metalu.
Po wyjaśnieniu struktury prFMN w miejscu aktywnym Fdc1 z Aspergillus niger (AnFdc1) zbadano aktywność prenylotrasferazy UbiX. Inkubacja UbiX z P. aeruginosa z utlenionym FMN i DMAP, a następnie redukcja ditionianem sodu prowadzi do powstania zredukowanego prFMN . Ta sama procedura, po której następuje ponowne utlenianie w tlenowych , prowadzi do rodnika prFMN . Beztlenowa inkubacja apo-AnFdc1 ze zredukowanym prFMN , a następnie ekspozycja na tlen prowadzi do aktywności dekarboksylazy, jednak inkubacja z rodnikiem prFMN nie dała aktywności apo-AnFdc1. Sugeruje to, że zredukowana postać prFMN może być prawidłowo utleniona przez UbiD / Fdc1 do odpowiedniego iminium prFMN (ryc. 2).
Mechanizm
P.aeruginosa UbiX (PaUbiX) ujawniły, że substrat DMAP jest umieszczony bezpośrednio nad pierścieniem izoalloksazyny FMN i że addukt dimetyloallilowy N5-C1' tworzy się jako pierwszy jako warunek wstępny do utworzenia wiązania C6-C3' i utworzenia czwartego nie -pierścień aromatyczny (Rysunek 1). Stwierdzono, że kilka konserwatywnych reszt wiąże grupę fosforanową DMAP z resztą E140, która sugerowana jest jako donor protonów w celu wzmocnienia fosforanowej grupy opuszczającej. Badanie sugeruje, że dwie reszty S15 i E49 odgrywają ważną rolę w deprotonacji N5 i tworzeniu wiązań N5-C1 '(Rysunek 1), mutacja E49Q poważnie wpłynęła na zdolność PaUbiX do aktywacji AnFdc1, a struktury krystaliczne E49Q nie ujawniły N5- Wiązanie C1' w ciągu 1-5 sekund po redukcji i szybkim zamrożeniu, w przeciwieństwie do PaUbiX typu dzikiego (WT), dla którego wiązanie N5-C1' obserwowano w ciągu 1-5 sekund. W badaniu tym nie udało się wychwycić żadnych związków pośrednich podczas tworzenia wiązania C3'-C6, ale zasugerowano, że atak nukleofilowy C6 na karbokation C3' zachodzi równocześnie z lub po protonowaniu C2' przez związany fosforan. Powstały addukt cykloheksadienu postulowano następnie, aby tworzył produkt końcowy poprzez aromatyzację towarzyszącą abstrakcji protonów przez S15 i E49. Mechanizm sugerowany dla PaUbiX pokazano na rycinie 1.
Odkrycia te zostały zaktualizowane w 2019 r. o nową publikację pokazującą, że pierwszy krok, tworzenie wiązania N5-C1', prawdopodobnie nastąpi za pośrednictwem mechanizmu S N 1 . Prowadzi to do ścisłego wymogu, aby ugrupowanie dimetyloallilu substratu zapoczątkowało reakcję. Ta sama praca wykazała, że alkilowanie N5 miało miejsce, niezależnie od tego, czy był to substrat DMAP, czy DMAPP w specyficznym dla DMAPP UbiX z Aspergillus niger (AnUbiX), dlatego ten etap jest niezależny od beta fosforanu obecnego w DMAPP. W tym samym enzymie AnUbiX wykazali, że alkilacja Fridela-Craftsa flawiny C6 zachodzi tylko przy użyciu substratu DMAPP. Mutacje w miejscu wiązania fosforanu w PaUbiX również nie były w stanie utworzyć wiązania C6-C3', ale można je było uratować przez dodanie fosforanu. Potwierdziło to, że UbiX katalizuje tworzenie wiązania C6-C3' poprzez katalizę kwasowo-zasadową fosforanem (i pirofosforanem).
