Entomokultura
Entomokultura to poddziedzina rolnictwa komórkowego , która w szczególności zajmuje się produkcją tkanki owadów in vitro . Opiera się na zasadach bardziej ogólnie stosowanych w inżynierii tkankowej i ma naukowe podobieństwa do bakulowirusowych wektorów ekspresyjnych lub miękkiej robotyki . Dziedzina ta została zaproponowana głównie ze względu na jej potencjalną przewagę techniczną nad komórkami ssaków w wytwarzaniu hodowanego mięsa. Nazwa pola została ukuta przez Natalie Rubio z Tufts University .
Proces
Entomokultura funkcjonuje na tych samych zasadach, co ogólnie rolnictwo komórkowe. Po pierwsze, komórki embrionalne pochodzą od owada. Embrionalne komórki macierzyste są komórkami totipotencjalnymi, co oznacza, że zachowują zdolność do różnicowania się w dowolne lub wszystkie rodzaje wyspecjalizowanych komórek. Komórki te można pobrać z hodowli pierwotnych (bezpośrednio od zwierzęcia) lub z kriokonserwowanych kultur wtórnych. Te komórki macierzyste są następnie zanurzane w pożywce hodowlanej , aby mogły się rozmnażać. Pożywki hodowlane składają się z pożywek podstawowych, które są kompozycją różnych składników odżywczych niezbędnych do wzrostu komórek. Ta mieszanina dyfunduje do komórki, a gdy zużyje wystarczającą ilość, dzieli się i populacja się rozmnaża. Aby zoptymalizować wzrost, ta pożywka hodowlana jest zwykle uzupełniana innymi białkami i czynnikami wzrostu . Takie dodatki są często wytwarzane przez rekombinowaną produkcję białek — translację odpowiednich genów do bakterii, które następnie poddaje się fermentacji w celu wytworzenia kilku kopii białka. Rozmnożoną liczbę komórek macierzystych można następnie zaszczepić na rusztowaniu w celu zainicjowania większej kompozycji lub umieścić bezpośrednio w bioreaktorze . Bioreaktor odtwarza cechy środowiskowe, które w innym przypadku byłyby naśladowane in vivo , w tym temperaturę i osmolarność, w celu promowania różnicowania komórek w tkankę mięśniową.
W bioreaktorze komórki macierzyste przechodzą miogenezę — różnicowanie się w tkankę mięśniową. Jest to złożony proces obejmujący tworzenie komórek założycielskich i mioblastów zdolnych do fuzji. Około 4–25 mioblastów zdolnych do fuzji łączy się następnie z jedną komórką założycielską, tworząc wielojądrowe włókna mięśniowe, które wspólnie stają się mięśniami larw.
Kiedy tkanka mięśniowa rozwija się in vivo , mięsień larwy ulega zniszczeniu podczas metamorfozy. Podobny proces zachodzi z udziałem dorosłych prekursorów mięśni, które wykorzystują stary mięsień larwy jako szablon do stworzenia dojrzałego mięśnia. Jednak proces ten nie ma istotnego znaczenia w in vitro , ponieważ rozwój jest zatrzymywany przed metamorfozą.
Porównanie z hodowlą komórek ssaków
Jeśli chodzi o hodowane mięso, zaproponowano entomokulturę głównie ze względu na jej potencjalne zalety w porównaniu z hodowlą komórek ssaków. Takie zalety można przypisać różnicom biologicznym między dwoma typami komórek, które umożliwiają komórkom owadzim tolerowanie warunków bardziej sprzyjających produkcji przemysłowej.
Temperatura . Komórki ssaków rozwijające się in vivo inkubuje się w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Symulowanie takiego ciepłego klimatu w bioreaktorze wymaga nakładów energii, co zwiększa koszty produkcji. Tkanka owadów może być hodowana na dużą skalę w temperaturze pokojowej lub niższej z niewielką lub żadną przeszkodą w rozwoju komórek.
Warunki kulturowe . Gdy komórki ssaków trawią i metabolizują glukozę, wytwarzają produkty uboczne, takie jak kwas mlekowy , które gromadzą się i zakwaszają środowisko komórki. Zdolność komórek do pobierania składników odżywczych zależy od pH środowiska — musi mieścić się w określonym przedziale dla optymalnego wzrostu. Akumulacja kwasu mlekowego prowadzi do gorszych warunków wzrostu komórki. W związku z tym środowisko musi zostać „zrównoważone” - co zwykle osiąga się poprzez wymianę całej pożywki hodowlanej tak często, jak co 2–3 dni. Jednak nasycone pożywki hodowlane mogą nadal zawierać żywe składniki odżywcze, co sprawia, że praktyka jest nieekonomiczna i kosztowna. Komórki owadów częściowo omijają produkcję mleczanu, ale są również tolerancyjne na bardziej kwaśne środowiska. Gdy porównano wzrost komórek owadzich przy pH 5,5, 6,5 i 7,5, zauważono pomijalną różnicę. W rezultacie w kulturach owadów można wymieniać pożywki nawet co 90 dni. Jest to potęgowane przez fakt, że komórki owadów nie wyczerpują dodanych składników odżywczych tak szybko, jak komórki ssaków. Spożywają trójglicerydy , glukozę i białka w wolniejszym tempie, co sugeruje, że mają bardziej wydajne szlaki metaboliczne. Ponadto hodowle komórek owadzich są zazwyczaj zanieczyszczone komórkami lipidowymi zwanymi trofocytami lub witellofagami, które są prekursorami komórek żółtka jaja owadów. Komórki te są naturalnym źródłem tłuszczu, który mogą spożywać inne komórki owadzie.
Osmolarność . Komórki ssaków wymagają również stosunkowo dokładnej miary dwutlenku węgla i tlenu do wzrostu — w związku z tym hodowle są zwykle uzupełniane dodatkowymi 5% dwutlenkiem węgla. Owady mogą obejść się bez tego dodatku.
Pożywki hodowlane bez surowicy . Pożywki hodowlane są instrumentalną częścią rolnictwa komórkowego i generowania hodowanych tkanek, ponieważ skutecznie pozwalają naukowcom rozpocząć od stosunkowo małej próbki zwierzęcych komórek macierzystych i skończyć z wystarczającą ilością, aby utworzyć całą tkankę. Aby się rozmnażać, komórka potrzebuje nie tylko niezbędnych składników odżywczych i makrocząsteczek, ale także czynników wzrostu. Kiedy komórki ssaków rosną in vivo , te czynniki wzrostu są dostarczane przez krew zwierzęcia. Aby to powtórzyć, pożywka hodowlana zwykle składa się z podstawowej mieszanki uzupełnionej dodatkowymi czynnikami wzrostu. Pożywka podstawowa stanowi większość kultury i zawiera większość składników odżywczych, podczas gdy czynniki wzrostu są dodawane w śladowych ilościach. W rezultacie naturalnym punktem wyjścia jest połączenie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) z pożywką hodowlaną.
FBS jest nieco kontrowersyjny, ponieważ pochodzi z krwi płodu krowy mlecznej. Dwie kwestie związane z tym są takie, że a) opiera się na zwierzętach, a tym samym pokonuje cel rolnictwa komórkowego i b) jest drogi, ponieważ jest tak niedostępny. Ponadto, z naukowego punktu widzenia, FBS jest chemicznie niezdefiniowany, co oznacza, że jego skład różni się u różnych zwierząt. Ze względu na spójność badań nie jest to pożądane. Idealna pożywka hodowlana to taka, która jest prosta, może stymulować proliferację, nie polega na zwierzętach, jest dostępna i tania. Ponieważ jednak komórki ssaków opierają się na złożonej gamie czynników wzrostu, znalezienie pożywki hodowlanej, która spełnia wszystkie pięć z tych kryteriów, jest ciągłym wyzwaniem. Z drugiej strony komórki owadów są organizmami prostszymi biologicznie niż ssaki. Zawierają raczej płyn zwany hemolimfą niż krew, więc nie polegają na tych samych czynnikach wzrostu, co komórki ssaków. Zamiast tego, pożywka dla komórek owadzich zazwyczaj wykorzystuje pożywkę podstawową (taką jak pożywka Eagle's, pożywka Grace's Insect lub pożywka Schneider's Drosophila), która jest uzupełniona dodatkami na bazie roślin, takimi jak drożdże, prymatony RL, hydrolizaty, lipidy i peptydy pluronic.
Kultury zawiesinowe . Kiedy komórki mięśniowe ssaków rosną in vivo , podstawowa część ich proliferacji polega na ich przyczepianiu się do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Aby odtworzyć tę zależność, komórki ssaków są zwykle hodowane w przylegających monowarstwach — hodowlach, w których komórki rosną na podłożu w warstwach o grubości zaledwie jednej komórki. Wymaga to zastosowania bioreaktorów o dużej powierzchni, co w skali przemysłowej jest niewykonalne. Alternatywą jest użycie mikronośników , czyli małych kawałków materiału, które unoszą się w pożywce hodowlanej w celu zwiększenia całkowitej powierzchni, do której komórki mogą się przyczepić. Wprowadza to również konieczność unaczynienia . Kiedy komórki ssaków hoduje się w hodowlach adherentnych, komórki nie mające bezpośredniego kontaktu z pożywką hodowlaną przestają rosnąć, tworząc centra martwicze . W przeciwieństwie do komórek ssaków, komórki owadów mogą również rosnąć bez przyczepienia do czegokolwiek – lub w kulturach zawiesinowych . Oznacza to, że bioreaktory nie potrzebują dużej powierzchni, a zamiast tego mogą być produkowane w znacznie bardziej praktycznych kształtach.