Genetycznie zakodowany wskaźnik napięcia

Genetycznie zakodowany wskaźnik napięcia (lub GEVI ) jest białkiem , które może wykrywać potencjał błonowy w komórce i powiązać zmianę napięcia z formą wyjściową, często poziomem fluorescencji . Jest to obiecujące optogenetycznej , które umożliwia eksport sygnałów elektrofizjologicznych z hodowanych komórek, żywych zwierząt, a ostatecznie z ludzkiego mózgu. Przykłady godnych uwagi GEVI obejmują ArcLight, ASAP1, ASAP3, Archons, SomArchon i Ace2N-mNeon.

Historia

Pomimo tego, że pomysł optycznego pomiaru aktywności neuronów został zaproponowany pod koniec lat 60. XX wieku, pierwszy udany GEVI, który był wystarczająco wygodny do rzeczywistego użytku, nie został opracowany, dopóki technologie inżynierii genetycznej nie osiągnęły dojrzałości pod koniec lat 90. Pierwszy GEVI, nazwany FlaSh, został skonstruowany przez fuzję zmodyfikowanego zielonego białka fluorescencyjnego z wrażliwym na napięcie kanałem K ⁺ ( Shaker ). W przeciwieństwie do białek fluorescencyjnych, odkrycie nowych GEVI rzadko było inspirowane naturą, ponieważ trudno jest znaleźć organizm, który w naturalny sposób ma zdolność zmiany swojej fluorescencji w zależności od napięcia. Dlatego nowe GEVI są w większości produktami inżynierii genetycznej i białkowej.

Aby znaleźć nowe GEVI, można zastosować dwie metody: racjonalny projekt i ukierunkowana ewolucja . Pierwsza metoda przyczynia się do większości nowych wariantów GEVI, ale ostatnie badania z wykorzystaniem ukierunkowanej ewolucji wykazały obiecujące wyniki w optymalizacji GEVI.

Struktura

GEVI może mieć wiele projektów konfiguracji w celu realizacji funkcji wykrywania napięcia. Istotną cechą struktury GEVI jest to, że musi ona znajdować się na błonie komórkowej. Koncepcyjnie struktura GEVI powinna umożliwiać wykrywanie różnicy napięcia i zgłaszanie jej poprzez zmianę fluorescencji. Zwykle domena wykrywająca napięcie (VSD) GEVI rozciąga się przez błonę i jest połączona z białkiem (białkami) fluorescencyjnymi. Jednak nie jest konieczne, aby wykrywanie i raportowanie odbywało się w różnych strukturach, np. Archontach.

Ze względu na strukturę GEVI można podzielić na cztery kategorie w oparciu o obecne odkrycia: (1) GEVI zawierają parę fluorescencyjnych białek FRET, np. np. MacQ-mCitrine, (4) pojedynczy FP ze specjalnymi typami domen wykrywających napięcie, np. ASAP1. Większość GEVI opiera się na fosfatazie wrażliwej na napięcie Ciona intestinalis (Ci-VSP lub Ci-VSD (domena)), którą odkryto w 2005 roku na podstawie badań genomicznych organizmu. Niektóre GEVI mogą mieć podobne komponenty, ale z innym ich rozmieszczeniem. Na przykład ASAP1 i ArcLight używają VSD i jednego FP, ale FP ASAP1 znajduje się na zewnątrz komórki, podczas gdy ArcLight jest wewnątrz, a dwa FP VSFP-Butterfly są oddzielone przez VSD, podczas gdy dwa FP Syrenki są stosunkowo blisko siebie.

Tabela GEVI i ich struktura

GEVI	Rok	Wyczuwanie	Raportowanie	Prekursor
Błysk	1997	Wytrząsarka (kanał K + )	GFP	-
VSFP1	2001	Szczur Kv2.1 (K + kanał)	FRET : CFP i YFP	-
SPARC	2002	Szczur Na + kanał	GFP	-
VSFP2	2007	Ci-VSD	FRET : CFP (cerulean) i YFP (cytryn)	VSFP1
Migotać	2007	Kv1.4 (K + kanał)	YFP	Błysk
VSFP3.1	2008	Ci-VSD	WPRyb	VSFP2
Syrena	2008	Ci-VSD	FRET : Marine GFP (mUKG) i OFP (mKOκ)	VSFP2
hVOS	2008	Dipikrylamina	GFP	-
VSFP z przesunięciem ku czerwieni	2009	Ci-VSD	RFP/YFP (Citrine, mOrange2, TagRFP lub mKate2)	VSFP3.1
rekwizyty	2011	Zmodyfikowana proteorodopsyna pochłaniająca zieleń (GPR)	Taki sam jak lewy	-
Zahra, Zahra 2	2012	Nv-VSD, Dr-VSD	FRET : CFP (cerulean) i YFP (cytryn)	VSFP2
ArcLight	2012	Ci-VSD	Zmodyfikowany superekliptyczny pHluorin	-
Łuk	2012	Archaerhodopsyna 3	Taki sam jak lewy	-
Elektryczny Pk	2012	Ci-VSD	Kołowo permutowany EGFP	VSFP3.1
VSFP-Butterfly	2012	Ci-VSD	FRET : YFP (mCitrine) i RFP (mKate2)	VSFP2
VSFP-CR	2013	Ci-VSD	FRET : GFP (koniczyna) i RFP (mRuby2)	VSFP2.3
Syrenka2	2013	Ci-VSD	FRET : CFP (seCFP2) i YFP	Syrena
Mac GEVI	2014	Mac rodopsyna (akceptor FRET)	Doner FRET: mCitrine lub mOrange2	-
QuasAr1, QuasAr2	2014	Zmodyfikowana Archaerhodopsyna 3	Taki sam jak lewy	Łuk
Łucznik	2014	Zmodyfikowana Archaerhodopsyna 3	Taki sam jak lewy	Łuk
JAK NAJSZYBCIEJ1	2014	Zmodyfikowany Gg-VSD	Kołowo permutowany GFP	-
Ace GEVI	2015	Zmodyfikowana rodopsyna Ace	Donator FRET: mNeonGreen	Mac GEVI
ArcBłyskawica	2015	Ci-VSD	Zmodyfikowany superekliptyczny pHluorin	ArcLight
pado	2016	Kanał protonowy bramkowany napięciem	Superekliptyczny pHluorin	-
JAK NAJSZYBCIEJ	2016	Zmodyfikowany Gg-VSD	Kołowo permutowany GFP	JAK NAJSZYBCIEJ1
FlicR1	2016	Ci-VSD	Zapytanie ofertowe z permutacją kołową (mApple)	VSFP3.1
Bongwoori	2017	Ci-VSD	Zmodyfikowany superekliptyczny pHluorin	ArcLight
ASAP2s	2017	Zmodyfikowany Gg-VSD	Kołowo permutowany GFP	JAK NAJSZYBCIEJ1
ASAP-Y	2017	Zmodyfikowany Gg-VSD	Kołowo permutowany GFP	JAK NAJSZYBCIEJ1
(pa)QuasAr3(-s)	2019	Zmodyfikowana Archaerhodopsyna 3	Taki sam jak lewy	QuasAr2
Voltron(-ST)	2019	Zmodyfikowana rodopsyna Ace (Ace2)	Dawca FRET: Janelia Fluor (chemikalia)	-
JAK NAJSZYBCIEJ3	2019	Zmodyfikowany Gg-VSD	Kołowo permutowany GFP	ASAP2s
JEDI-2P	2022	Zmodyfikowany Gg-VSD	Kołowo permutowany GFP	ASAP2s

1. ^↑ Nazwy zapisane kursywą oznaczają GEVI bez nazwy.

Charakterystyka

GEVI można ocenić na podstawie wielu cech. Cechy te można podzielić na dwie kategorie: wydajność i kompatybilność. Właściwości użytkowe obejmują jasność, fotostabilność , czułość, kinetykę (szybkość), liniowość odpowiedzi itp., podczas gdy właściwości kompatybilności obejmują toksyczność ( fototoksyczność ), lokalizację błony plazmatycznej, zdolność adaptacji obrazowania tkanek głębokich itp. Na razie nie istnieją żadne GEVI spełnia wszystkie pożądane właściwości, więc poszukiwanie idealnego GEVI jest nadal dość konkurencyjnym obszarem badawczym.

Zastosowania i zalety

Różne typy GEVI są opracowywane w wielu biologicznych lub fizjologicznych obszarach badawczych. Uważa się, że przewyższa konwencjonalne metody wykrywania napięcia, takie jak zapisy elektrofizjologiczne oparte na elektrodach , obrazowanie wapnia lub barwniki czułe na napięcie . Ma subkomórkową rozdzielczość przestrzenną i rozdzielczość czasową tak niską, jak 0,2 milisekundy, o rząd wielkości szybszą niż obrazowanie wapnia. Pozwala to na wierność wykrywania impulsów porównywalną z elektrofizjologią opartą na elektrodach, ale bez inwazyjności. Naukowcy wykorzystali go do zbadania komunikacji neuronowej nienaruszonego mózgu ( Drosophila lub myszy), pobudzenia elektrycznego bakterii ( E. coli ) i kardiomiocytów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych .

Przyszłe kierunki

Przyszły kierunek rozwoju firmy GEVI jest ściśle powiązany z docelowymi zastosowaniami. Gdy nowsze generacje układów GEVI przezwyciężą słabą wydajność układów pierwszej generacji, otworzy się więcej możliwości wykorzystania układów GEVI w bardziej wymagających i wszechstronnych zastosowaniach. Podobnie jak wiele innych biosensorów i siłowników białkowych, gdy przekroczy początkowy próg praktyczności, będzie więcej prób przekształcenia narzędzia w celu jego wykorzystania w różnych zastosowaniach docelowych, z których każdy będzie kładł inny nacisk i wymagania dotyczące podzbioru wskaźników wydajności. Na przykład JEDI-2P, najnowsza generacja GEIV, jest szybkim, czułym, jasnym i fotostabilnym czujnikiem kompatybilnym z dwoma fotonami, który jest uważany za prawie idealny do wielu wymagających zastosowań w obrazowaniu głębokich tkanek. Jednak autorzy JEDI-2P stwierdzili, że czujnik o polaryzacji ujemnej (od jasnego do ciemnego) jest dobry do wykrywania podprogowych depolaryzacji i hiperpolaryzacji, ale czujniki o ruchu dodatnim (od ciemnego do jasnego) mogą być lepsze do wykrywania skoków. Możemy argumentować, że zaprojektowanie (ekranowanie) idealnego czujnika wymaga wysiłku, ale często bardziej przekonującym powodem jest to, że po prostu nie ma jednomyślnej definicji takiej doskonałości. Na przykład naukowiec może preferować czujniki o różnych kolorach emisji i wzbudzenia, aby były kompatybilne spektralnie z innymi siłownikami optogenetycznymi. Ostatnio, aby zrekompensować niski stosunek sygnału do szumu (SNR) spowodowany słabą jasnością GEVI, zastosowano kilka metod odszumiania w celu zwiększenia SNR.