Kaede (białko)

Kaede jest fotoaktywowalnym białkiem fluorescencyjnym, naturalnie pochodzącym z korala kamiennego Trachyphyllia geoffroyi . Jego nazwa oznacza po japońsku „klon” . Pod wpływem promieniowania ultrafioletowego (350–400 nm) Kaede przechodzi nieodwracalną fotokonwersję z zielonej fluorescencji do czerwonej fluorescencji.

Kaede jest białkiem homotetramerycznym o wielkości 116 kDa . Struktura tetrameryczna , ponieważ jej pierwotna struktura ma tylko 28 kDa. Ta tetrameryzacja prawdopodobnie powoduje, że Kaede ma niską tendencję do tworzenia agregatów po fuzji z innymi białkami.

Odkrycie

Właściwość fotokonwertowanego fluorescencyjnego białka Kaede została nieoczekiwanie odkryta i po raz pierwszy opisana przez Ando i in. w Proceedings of the United States National Academy of Sciences . Odkryto, że porcja białka Kaede emituje czerwoną fluorescencję po pozostawieniu na stole i wystawieniu na działanie promieni słonecznych. Późniejsza weryfikacja wykazała, że ​​Kaede, które pierwotnie było zielone fluorescencyjne, po ekspozycji na światło UV ulega fotokonwersji, stając się czerwoną fluorescencyjną. Nazywała się wtedy Kaede.

Nieruchomości

Właściwość fotokonwersji w Kaede jest wnoszona przez tripeptyd , His62-Tyr63-Gly64, który działa jak zielony chromofor , który można przekształcić w czerwony. Po zsyntetyzowaniu Kaede chromofor, 4- (p-hydroksybenzylideno) -5-imidazolinon, pochodzący z tripeptydu, pośredniczy w zielonej fluorescencji w Kaede. Pod wpływem promieniowania UV białko Kaede ulega niekonwencjonalnemu rozszczepieniu między amidami azot i węgiel α (Cα) w His62 poprzez formalną reakcję β-eliminacji. Po utworzeniu podwójnego wiązania między His62-Cα i –Cβ, koniugacja π rozciąga się na pierścień imidazolowy His62. Powstaje nowy chromofor, 2-[(1E)-2-(5-imidazolilo)etenylo]-4-(p-hydroksybenzylideno)-5-imidazolinon, który ma właściwości emitujące czerwień.

Rozszczepienie tripeptydu analizowano za pomocą analizy SDS-PAGE. Nieprzekształcony zielony Kaede pokazuje jeden prążek przy 28 kDa, gdzie obserwuje się dwa prążki przy 18 kDa i 10 kDa dla przekształconego czerwonego Kaede, co wskazuje, że rozszczepienie ma kluczowe znaczenie dla fotokonwersji.

Przesunięcie widma absorpcji i emisji w Kaede jest spowodowane rozszczepieniem tripeptydu. Przed fotokonwersją Kaede wyświetla główne maksimum absorpcji przy 508 nm, któremu towarzyszy lekkie ramię przy 475 nm. Kiedy jest wzbudzony przy 480 nm, emitowana jest zielona fluorescencja z pikiem przy 518 nm. Kiedy Kaede jest naświetlany światłem UV lub fioletowym, główny pik absorpcji przesuwa się do 572 nm. Po wzbudzeniu przy 540 nm Kaede wykazał maksimum emisji przy 582 nm z ramieniem przy 627 nm i pikiem przy 518 nm. Po tej fotokonwersji emitowana jest czerwona fluorescencja.

Fotokonwersja w Kaede jest nieodwracalna. Ekspozycja w ciemności lub oświetlenie przy 570 nm nie może przywrócić pierwotnej zielonej fluorescencji. Zmniejszoną fluorescencję obserwuje się w czerwonym, poddanym fotokonwersji Kaede, gdy jest on intensywnie wystawiony na działanie światła o długości fali 405 nm, po czym następuje częściowe odzyskanie po kilku minutach.

Aplikacje

Podobnie jak wszystkie inne białka fluorescencyjne, Kaede może być regionalnymi markerami optycznymi do ekspresji genów i znakowania białek do badania zachowań komórek.

Jedną z najbardziej użytecznych aplikacji jest wizualizacja neuronów . Nakreślenie pojedynczego neuronu jest trudne ze względu na długie i cienkie wypustki, które splatają się z innymi neuronami. Nawet jeśli hodowane neurony są znakowane białkami fluorescencyjnymi, nadal trudno je zidentyfikować indywidualnie ze względu na gęste opakowanie.

W przeszłości taką wizualizację można było wykonać konwencjonalnie, wypełniając neurony żółcią lucyferową lub sulforodaminą, co jest pracochłonną techniką.[1] Po odkryciu białka Kaede okazało się, że jest ono przydatne do określania poszczególnych neuronów. Neurony są transfekowane cDNA białka Kaede i są napromieniowane promieniowaniem UV. Czerwone, fotokonwertowane białko Kaede ma swobodną dyfuzyjność w komórce z wyjątkiem jądra i rozprzestrzenia się po całej komórce, w tym w dendrytach i aksonie. Ta technika pomaga rozplątać złożone sieci ustanowione w gęstej kulturze. Poza tym, oznaczając neurony różnymi kolorami przez napromieniowanie UV z różnym czasem trwania, można wizualizować miejsca kontaktu między neuronami czerwonymi i zielonymi będącymi przedmiotem zainteresowania.

Zdolność wizualizacji poszczególnych komórek jest również potężnym narzędziem do identyfikacji dokładnej morfologii i zachowań migracyjnych poszczególnych komórek w żywych skrawkach korowych . Dzięki białku Kaede można śledzić konkretną parę komórek potomnych w sąsiednich komórkach Kaede-dodatnich w strefie komorowej skrawków mózgu myszy . Granice komórka-komórka komórek potomnych są wizualizowane i można opisać położenie i odległość między dwiema lub więcej komórkami.

Ponieważ zmiana koloru fluorescencji jest indukowana przez światło UV, znakowanie komórek i struktur subkomórkowych jest skuteczne nawet wtedy, gdy indukowana jest tylko częściowa fotokonwersja.

Zalety jako znacznika optycznego

Ze względu na specjalną właściwość fotoprzełączanej fluorescencji, białko Kaede ma kilka zalet jako optyczny marker komórkowy .

Po fotokonwersji fotokonwertowane białko Kaede emituje jasną i stabilną czerwoną fluorescencję. Ta fluorescencja może trwać miesiącami bez warunków beztlenowych. Ponieważ ten czerwony stan Kaede jest jasny i stabilny w porównaniu ze stanem zielonym, a nieprzekształcony zielony Kaede emituje bardzo niską intensywność czerwonej fluorescencji, czerwone sygnały zapewniają kontrast.

Poza tym przed fotokonwersją Kaede emituje jasnozieloną fluorescencję, która umożliwia wizualizację lokalizacji niefotoaktywowanego białka. Jest to lepsze niż inne białka fluorescencyjne, takie jak PA-GFP i KFP1, które wykazują niską fluorescencję tylko przed fotoaktywacją.

Ponadto, ponieważ zarówno zielona, ​​jak i czerwona fluorescencja Kaede są wzbudzane przez niebieskie światło o długości fali 480 nm do obserwacji, światło to nie wywoła fotokonwersji. Dzięki temu oświetlenie do obserwacji i fotokonwersji można całkowicie rozdzielić.

Ograniczenia

Pomimo przydatności w śledzeniu komórek i wizualizacji komórek Kaede, istnieją pewne ograniczenia. Chociaż Kaede zmieni kolor na czerwony po wystawieniu na działanie światła UV lub fioletowego i wykaże 2000-krotny wzrost stosunku fluorescencji czerwonej do zielonej, użycie zarówno czerwonego, jak i zielonego pasma fluorescencji może powodować problemy w eksperymentach z wieloma etykietami. Tetrameryzacja Kaede może zakłócić lokalizację i transport białek fuzyjnych. Ogranicza to użyteczność Kaede jako białka fuzyjnego .

Znaczenie ekologiczne

Właściwość fotokonwersji Kaede nie tylko przyczynia się do zastosowania w znakowaniu białek i śledzeniu komórek, ale jest również odpowiedzialna za ogromne zróżnicowanie koloru koralowców kamienistych, Trachyphyllia geoffroyi . W świetle słonecznym, z powodu fotokonwersji Kaede, macki i dyski zmienią kolor na czerwony. Ponieważ zielona fluorescencyjna Kaede jest syntetyzowana w sposób ciągły, korale te ponownie wydają się zielone, gdy powstaje więcej nieprzekształconego Kaede. Ze względu na różne proporcje fotokonwertowanego i nieprzetworzonego Kaede, u koralowców występuje duża różnorodność kolorów.

•    Tomura, M.; Yoshida, N.; Tanaka, J.; Karasawa, S.; Miwa, Y.; Miyawaki, A.; Kanagawa, O. (2008). „Monitorowanie ruchu komórkowego in vivo za pomocą transgenicznych myszy z fotokonwertowalnym białkiem fluorescencyjnym„ Kaede ”” . Obrady Narodowej Akademii Nauk . 105 (31): 10871–10876. Bibcode : 2008PNAS..10510871T . doi : 10.1073/pnas.0802278105 . PMC 2504797 . PMID 18663225 .
•    Dittrich, PS; Schäfer, SP; Schwille, P. (2005). „Charakterystyka fotokonwersji w reakcji fluorescencyjnego białka Kaede na poziomie pojedynczej cząsteczki” . Dziennik biofizyczny . 89 (5): 3446–3455. Bibcode : 2005BpJ....89.3446D . doi : 10.1529/biophysj.105.061713 . PMC 1366840 . PMID 16055537 .