LNCaP
LNCaP to linia komórek ludzkich powszechnie stosowana w onkologii . Komórki LNCaP to na androgeny ludzkie komórki gruczolakoraka prostaty , pochodzące z przerzutów do lewego nadobojczykowego węzła chłonnego od 50-letniego mężczyzny rasy kaukaskiej w 1977 r. Są to przylegające komórki nabłonkowe rosnące w agregatach i jako pojedyncze komórki.
Jedną z głównych przeszkód w prowadzeniu najbardziej istotnych klinicznie badań nad rakiem prostaty (PCa) był brak linii komórkowych, które ściśle naśladują postęp choroby u ludzi. Dwie cechy charakterystyczne ludzkiego raka gruczołu krokowego z przerzutami obejmują przesunięcie agresywnego PCa ze stanu wrażliwości na androgeny do stanu niewrażliwego na androgeny (AI) oraz skłonność PCa do przerzutów do kości. Chociaż generowanie linii komórkowych AI było dość udane, jak wykazano w „klasycznych” liniach komórkowych DU145 i PC3 , zachowanie tych komórek w kościach nie w pełni naśladuje kliniczną chorobę człowieka. Dobrze wiadomo, że przerzuty ludzkiego PCa do kości tworzą raczej zmiany osteoblastyczne niż zmiany osteolityczne obserwowane w innych nowotworach, takich jak rak piersi. Podobnie komórki PC-3 i DU145 tworzą guzy osteolityczne. Aby opracować model komórek AI-PCa, który bardziej naśladuje chorobę kliniczną, wygenerowano sublinie LNCaP, aby zapewnić jak dotąd najbardziej istotne klinicznie narzędzia do hodowli tkankowych.
Historia
Linię komórkową LNCaP ( rak węzła chłonnego gruczołu krokowego ) ustalono z przerzutowej zmiany ludzkiego gruczolakoraka gruczołu krokowego . Komórki LNCaP łatwo rosną in vitro (do 8 x 105 komórek /cm2; czas podwojenia, 60 godz.), tworzą klony i są wysoce oporne na interferon ludzkich fibroblastów . Komórki LNCaP mają modalną liczbę chromosomów od 76 do 91, co wskazuje na ludzki męski kariotyp z kilkoma chromosomami markerowymi . Złośliwe właściwości komórek LNCaP utrzymują się u pozbawionych grasicy nagich myszy, u których rozwijają się guzy w miejscu wstrzyknięcia i wykazują podobny czas podwojenia na żywo .
We frakcjach cytozolowych i jądrowych obecne są swoiste receptory androgenowe i estrogenowe o wysokim powinowactwie . Linia LNCaP reaguje hormonalnie , co wykazano w modulacji wzrostu komórek i produkcji kwaśnej fosfatazy za pomocą 5-alfa-dihydrotestosteronu in vitro . Komórki LNCaP wykazują również ekspresję antygenu specyficznego dla prostaty (PSA). In vivo u samców myszy guzy rozwijają się wcześniej iz większą częstotliwością niż u samic, a manipulacje hormonalne pokazują, że częstość rozwoju guza koreluje z poziomem androgenów w surowicy. Szybkość wzrostu guza jest jednak niezależna od płci lub statusu hormonalnego gospodarza.
C4/C5 i C4-2
Wu i in. (1994) reprodukowali pochodzące od człowieka nowotwory LNCaP u myszy z obniżoną odpornością przez jednoczesne wstrzyknięcie komórek LNCaP z ludzkimi fibroblastami kości MS. Komórki wstrzyknięto podskórnie w wiele miejsc w bok myszy i po około 4 tygodniach wzrostu guzy były łatwo wykrywalne w badaniu fizycznym i charakteryzowały się dużą szybkością wzrostu (17-33 mm3/dzień).
Aby powtórzyć charakterystyczne przesunięcie komórek PCa do AI, myszy gospodarza LNCaP kastrowano przez nacięcie środkowego moszny około 8 tygodni po wstrzyknięciu. Nowotwory utrzymywano w wykastrowanych żywicielach przez 4 do 5 tygodni, po czym zebrano pozostałe guzy. W sumie dwa podzbiory komórek zebrano od wykastrowanych gospodarzy: C4 i C5, zebrane odpowiednio po 4 i 5 tygodniach.
W celu dalszej selekcji komórek AI-PCa, podlinię C4 wstrzyknięto razem z ludzkimi fibroblastami MS do wykastrowanego gospodarza. Powstałe guzy wyizolowano i wygenerowano dodatkową podlinię, C4-2.
Porównania kariotypów wskazują, że komórki LNCaP hodowane w nienaruszonych gospodarzach (podlinia M) mają modalną liczbę dystrybucji chromosomów 83, podlinii C4 i C5 z 85, a podlinię C4-2 z 83.
Aby dodatkowo zweryfikować, czy te komórki były pochodzenia ludzkiego, analiza kariotypu wykazała, że rodzicielskie komórki LNCaP miały 7 różnych chromosomów markerowych, z dwiema kopiami każdego. Podlinie M, C4, C5 i C4-2 zawierały większość chromosomów markerowych, przy czym podlinia M była najbardziej podobna do macierzystych komórek LNCaP. C4, C5 i C4-2 różnią się tylko nieznacznie od LNCaP i podlinii M z dodatkiem chromosomu markerowego wynikającego z dodania segmentu do chromosomu 6. Chromosom Y nie występuje w większości komórek C4, C5 i C4-2, sugerując poważne zmiany chromosomalne.
Podlinie C4, C5 i C4-2 dobrze rosną w identycznych warunkach hodowli tkankowej jak LNCaP z podobnymi szybkościami wzrostu. Rodzicielskie sublinie LNCaP, M, C4 i C5 mają podobne wyjściowe poziomy ekspresji genów dekarboksylazy ornityny (ODC) i antygenu specyficznego dla prostaty (PSA), jednak podlinie M, C4 i C5 wyrażają 5-10 razy więcej mRNA PSA. M, C4, C5 i C4-2 również wyrażały zredukowany mRNA ludzkiego receptora androgenowego , jak oczekiwano w komórkach AI.
Niewrażliwość na androgeny Wszystkie sublinie leczono dihydrotestosteronem (DHT), ligandem o wysokim powinowactwie do AR. Traktowanie DHT wywołało znacznie zmniejszony wzrost komórek C4 i C5 i brak wzrostu komórek C4-2 w porównaniu z wysokim tempem wzrostu obserwowanym w komórkach LNCaP, co sugeruje zmniejszoną wrażliwość na androgeny w komórkach C4 i C5 oraz AI w komórkach C4-2. Test AR na całych komórkach wykazał również, że komórki LNCaP mają postać AR o znacznie wyższym powinowactwie (Kd = 159 pM) w porównaniu z C4-2 (Kd = 267 pM).
rakotwórczości C4 i C5 wykazują znacznie zwiększoną rakotwórczość po wstrzyknięciu nienaruszonym samcom myszy, w przeciwieństwie do rodzicielskich komórek LNCaP. C4 i C5 były również zdolne do tworzenia wysoce unaczynionych raków u wykastrowanych myszy po jednoczesnym wstrzyknięciu z ludzkimi fibroblastami MS. Podlinia C4-2 łatwiej tworzy nowotwory u nienaruszonych gospodarzy niż podlinie C4 i C5 i są one jedynymi komórkami zdolnymi do tworzenia guzów u wykastrowanego gospodarza bez równoczesnego wstrzyknięcia ludzkich fibroblastów kości MS. Te same guzy C4-2 barwiono na PSA i wydzielały wysokie poziomy PSA do pożywki wzrostowej.
C4-2B
Aby wygenerować podlinię przerzutów do kości, komórki C4-2 ortotopowo wstrzyknięto wykastrowanym samcom myszy. Komórki te tworzyły duże pierwotne guzy prostaty, węzłów chłonnych, a także guzy kostne. Izolacja tych guzów kostnych dała podlinię C4-2B. Komórki C4-2B były dodatnie pod względem PSA i cytokeratyny 8 , potwierdzając ich pochodzenie z prostaty. Co najważniejsze, barwienie immunohistochemiczne guzów C4-2B było dodatnie pod względem aktywności osteoblastów, co sugeruje indukcję tworzenia się guza osteoblastycznego odzwierciedlającą progresję ludzkiego PCa.
Podczas hodowli w „pożywce do promineralizacji”, która zawiera kwas askorbinowy (wiadomo, że promuje tworzenie szkieletopodobnej ECM w osteoblastach) i źródło fosforanu (do tworzenia hydroksyapatytu ), komórki C4-2B wytwarzają i zatrzymują około 8 razy więcej zmineralizowanego wapnia niż macierzyste LNCaP komórki. Komórki C4-2B wyrażają również wyższe poziomy osteoprotegeryny (OPG), fosfatazy alkalicznej , sialoproteiny kości (BSP), osteokalcyny (OCN), RANKL i osteonektyny (OSN) mRNA, z których wszystkie są silnie eksprymowane przez osteoblasty . Aktywność promotora osteoblastów jest również wyższa w komórkach C4-2B w porównaniu z LNCaP, na co wskazuje ekspresja czynnika transkrypcyjnego Cbfa1 . Jednocześnie BMP7 , znany induktor Cbfa1, jest również silniej wyrażany w komórkach C4-2B, co dodatkowo sugeruje wiele właściwości podobnych do osteoblastów.
Warianty niezależne od androgenów
LN95 pochodziły z LNCaP hodowanych w RPMI-1640 (bez czerwieni fenolowej) z 10% płodową surowicą bydlęcą oczyszczoną węglem drzewnym. Komórki LN95 różnią się od macierzystych komórek LNCaP morfologicznie, z wyraźnymi rozszerzeniami dendrytycznymi i molekularnie, receptora androgenowego podobną do ekspresji komórek AR-V7 High VCaP . Warto zauważyć, że komórki LN95 są znacznie bardziej inicjujące nowotwór niż ich rodzicielskie odpowiedniki in vivo .
LNCaP-AI (lub LN-AI) pochodziły z 6-miesięcznej hodowli macierzystych komórek LNCaP w surowicy pozbawionej węgla drzewnego. Chociaż LNCaP-AI są całkowicie niezależne od androgenów, zachowują wysoką ekspresję receptora androgenowego , niską ekspresję AR-V7 i pozostają wrażliwe na androgeny. Mechanizm wysoce proliferacyjnego fenotypu komórek LNCaP-AI wydaje się polegać na utracie ekspresji regulatora cyklu komórkowego (p21, p16) i zwiększonej antyapoptotycznej ekspresji Bcl2 .
Dalsza lektura
- Li H, Lovci MT, Kwon YS, Rosenfeld MG, Fu XD, Yeo GW (2008). „Określenie gęstości znaczników wymaganej do cyfrowej analizy transkryptomu: zastosowanie do modelu raka prostaty wrażliwego na androgeny” . Proc Natl Acad Sci USA . 105 (51): 20179–84. Bibcode : 2008PNAS..10520179L . doi : 10.1073/pnas.0807121105 . PMC 2603435 . PMID 19088194 .