Pst I

Pst I jest endonukleazą restrykcyjną typu II wyizolowaną z gatunku Gram-ujemnego Providencia stuartii .

Funkcjonować

Pst I rozcina DNA w rozpoznawanej sekwencji 5′-CTGCA/G-3′, tworząc fragmenty o spójnych końcach 3′. To rozszczepienie daje lepkie końce o długości 4 par zasad. PstI jest katalitycznie aktywny jako dimer. Obie podjednostki powiązane są 2-krotną osią symetrii, która w kompleksie z podłożem pokrywa się z osią diady sekwencji rozpoznawanej . Ma masę cząsteczkową 69 500 i zawiera 54 reszty dodatnie i 41 ujemnie naładowanych.

Sekwencja rozpoznania	Wytnij witrynę
5'CTGCAG 3' 3'GACGTC 5'	5'--CTGCA G--3' 3'--G ACGTC-5'

PstI (R/M) składa się z dwóch składników: enzymu restrykcyjnego przecinającego obcy DNA oraz metylotransferazy, która chroni nici natywnego DNA poprzez metylację zasady adeninowej wewnątrz rozpoznawanej sekwencji. Połączenie obu zapewnia mechanizm obronny przed inwazją wirusów. Metylotransferaza i endonukleaza są kodowane jako dwa oddzielne białka i działają niezależnie. W systemie PstI geny są kodowane na przeciwległych niciach i dlatego muszą być transkrybowane w sposób rozbieżny z oddzielnych promotorów . Miejsca inicjacji transkrypcji są oddzielone jedynie 70 parami zasad . Opóźnienie w ekspresji endonukleazy w stosunku do metylazy wynika z nieodłącznych różnic między tymi dwoma białkami. Endonukleaza jest dimerem wymagającym drugiego etapu składania, podczas gdy metylaza jest monomerem.

PstI jest funkcjonalnie równoważne BsuBI. Obydwa enzymy rozpoznają docelową sekwencję 5'CTGCAG. Układy enzymatyczne mają podobne metylotransferazy (41% identyczności aminokwasów), endonukleazy restrykcyjne (46% identyczności aminokwasów) i skład genetyczny (58% identyczności nukleotydów). Obserwacje te sugerują wspólną ewolucyjną .

Podczas badania preferencyjnego cięcia dwuniciowego DNA, endonukleaza restrykcyjna PstI wiąże się z plazmidowym DNA pSM1.

Klonowanie DNA

PstI jest enzymem użytecznym do klonowania DNA, ponieważ zapewnia selektywny system generowania hybrydowych cząsteczek DNA. Te hybrydowe cząsteczki DNA można następnie rozszczepić w zregenerowanych miejscach PstI. Jego zastosowanie nie ogranicza się do klonowania molekularnego; jest również stosowany w mapowaniu miejsc restrykcyjnych, genotypowaniu, Southern blot, polimorfizmie długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) i SNP. Jest to także izoschizomeru SalPI ze Streptomyces albus P.

Łupliwość

PstI preferencyjnie tnie oczyszczony DNA pSM1 bez wpływu superheliczności substratu. Jednakże nie wiadomo, czy skutki tego rozszczepienia występują po związaniu się z miejscem rozpoznawania lub po rozcięciu DNA. Jego zróżnicowane szybkości rozszczepiania w różnych miejscach restrykcyjnych wynikają z pięciu cech struktury dupleksowej. Bliskość końców liniowej cząsteczki DNA, zmienność sekwencji DNA w obrębie miejsc rozpoznawanych przez enzymy, niewielka odległość pomiędzy regionami o nietypowych sekwencjach DNA i miejscami rozpoznawania, i wreszcie specjalne struktury, takie jak pętle i spinki do włosów. Zbiorowy efekt tych pięciu czynników może wpływać na dostępność enzymu restrykcyjnego do jego miejsc rozpoznawania.