Regulowana cyklem komórkowym metylotransferaza

Rentgenowska struktura kryształu Caulobacter crescentus CcrM przedstawiająca homodimer CcrM w kompleksie z dwuniciowym DNA. Monomery białkowe są pokazane na niebiesko i zielono, podczas gdy DNA jest pokazane na brązowo. Zasady DNA w miejscu rozpoznawania GANTC są pokazane w pełnej rozdzielczości atomowej.

CcrM (lub M.CcrMI ) to metylotransferaza sierocego DNA , która bierze udział w kontrolowaniu ekspresji genów w większości Alphaproteobacteria . Enzym ten modyfikuje DNA poprzez katalizowanie z wysoką specyficznością przeniesienia grupy metylowej z substratu S-adenozylo-L-metioniny na pozycję N6 zasady adeniny w sekwencji 5'-GANTC-3'. W niektórych liniach, takich jak SAR11 , homologiczne enzymy posiadają specyficzność 5'-GAWTC-3'. W Caulobacter crescentus Ccrm jest wytwarzany pod koniec cyklu replikacji, kiedy miejsca rozpoznawane przez Ccrm są hemimetylowane, co powoduje szybką metylację DNA. CcrM jest niezbędny w innych alfaproteobakteriach, ale jego rola nie została jeszcze określona. CcrM to wysoce specyficzna metylotransferaza z nowym mechanizmem rozpoznawania DNA.

Rola CcrM w regulacji cyklu komórkowego

Metylacje to modyfikacje epigenetyczne, które u eukariontów regulują procesy takie jak różnicowanie komórek i embriogenezę, podczas gdy u prokariotów mogą odgrywać rolę w samorozpoznawaniu, ochronie DNA przed rozszczepieniem przez system endonukleaz restrykcyjnych lub w regulacji genów. Pierwsza funkcja jest kontrolowana przez restrykcyjny system metylacji, druga przez sieroce MTazy, takie jak Dam i CcrM.

Rola CcrM została scharakteryzowana w morskim organizmie modelowym Caulobacter crescentus , który jest odpowiedni do badania cyklu komórkowego i epigenetyki, ponieważ asymetrycznie dzieli się, generując różne potomstwo, komórkę łodygową i komórkę roju, o różnych fenotypach i regulacji genów. Komórka roju ma pojedynczą wici i pilusy polarne i charakteryzuje się ruchliwością, podczas gdy komórka ułożona w stos ma łodygę i jest przymocowana do podłoża. Komórka ułożona w stos wchodzi natychmiast w fazę S , podczas gdy komórka roju pozostaje w fazie G1 i różnicuje się w komórkę ułożoną przed ponownym wejściem w fazę S.

Ułożona komórka w fazie S będzie replikować swoje DNA w sposób półkonserwatywny, wytwarzając dwie hemimetylowane podwójne nici DNA, które zostaną szybko zmetylowane przez metylotransferazę CcrM, która jest wytwarzana dopiero pod koniec fazy S. Enzym w ciągu około 20 minut zmetyloje ponad 4 tysiące miejsc 5'-GANTC-3', a następnie zostanie zdegradowany przez proteazę LON . Ta szybka metylacja odgrywa ważną rolę w kontroli transkrypcji kilku genów i kontroluje różnicowanie komórek. Ekspresja CcrM jest regulowana przez główny regulator CtrA, a ponadto różne miejsca metylacji miejsc 5'-GANTC-3' regulują ekspresję CcrM, która wystąpi dopiero pod koniec fazy S, gdy te miejsca są hemimetylowane. W tym procesie CtrA reguluje ekspresję CcrM i ponad 1000 genów w stanie przed podziałem, a SciP zapobiega aktywacji transkrypcji CcrM w komórkach niereplikujących.

Rola CcrM w Alphaproteobacteria

Sieroce MTazy są powszechne u bakterii, a archea CcrM można znaleźć w prawie każdej grupie Alphaproteobacteria , z wyjątkiem Rickettsiales i Magnetococcales , a homologi można znaleźć w Campylobacterota i Gammaproteobacteria . Alphaproteobakterie to organizmy o różnych stadiach życia, od wolno żyjących po związane z podłożem, niektóre z nich to wewnątrzkomórkowe patogeny roślin, zwierząt, a nawet ludzi, w tych grupach CcrM muszą odgrywać ważną rolę w progresji cyklu komórkowego.

Wykazano, że regulacja chybienia CcrM powoduje poważne chybienie kontroli regulacji cyklu komórkowego i różnicowania w różnych alfaproteobakteriach; C. crescentus , roślinny symbiont Sinorhizobium meliloti oraz ludzki patogen Brucella abortus . Udowodniono również, że gen CcrM jest niezbędny dla żywotności różnych alfaproteobakterii.

Struktura i mechanizm rozpoznawania DNA

CcrM to metylotransferaza DNA typu II, która przenosi grupę metylową z donora metylu SAM na N6 adeniny w miejscach rozpoznawanych przez 5'-GANTC-3' hemimetylowanego DNA. W oparciu o kolejność konserwatywnych motywów, które tworzą wiązanie SAM, miejsce aktywne i domenę rozpoznawania celu w sekwencji CcrM, można ją sklasyfikować jako adeninową metylotransferazę N6 klasy β. Homologi CcrM w Alphaproteobacteria mają domenę C-końcową składającą się z 80 reszt, z niezbyt dobrze scharakteryzowaną funkcją.

CcrM charakteryzuje się wysokim stopniem dyskryminacji sekwencji, wykazując bardzo wysoką specyficzność dla miejsc GANTC w stosunku do miejsc AANTC, będąc w stanie rozpoznać i metylować tę sekwencję zarówno w dwu-, jak i jednoniciowym DNA. CcrM w kompleksie ze strukturą dsDNA został rozwiązany, pokazując, że enzym przedstawia nowy mechanizm interakcji DNA, otwierając bańkę w miejscu rozpoznawania DNA (skoordynowany mechanizm metylotransferaz polega na odwróceniu docelowej zasady), enzym oddziałuje z DNA tworząc homodimer z różnymi interakcjami monomerów.

CcrM jest wysoce wydajnym enzymem zdolnym do metylowania dużej liczby miejsc 5'-GANTC-3' w krótkim czasie, jednak jeśli enzym jest procesowy (enzym wiąże się z DNA i metyluje kilka miejsc metylacji przed dysocjacją) lub rozdzielczy ( enzym dysocjuje od DNA po każdej metylacji) jest to nadal przedmiotem dyskusji. Pierwsze doniesienia wskazywały na drugi przypadek, jednak nowsza charakterystyka CcrM wskazuje, że jest to enzym procesowy.