Sekwencja MNazy
MNase-seq , skrót od trawienia nukleazami mikrokokowymi z głębokim sekwencjonowaniem , jest techniką biologii molekularnej , która została po raz pierwszy wprowadzona w 2006 r. w celu pomiaru zajętości nukleosomów w genomie C. elegans , a następnie została zastosowana do ludzkiego genomu w 2008 r. Chociaż termin „MNase-seq” został ukuty dopiero rok później, w 2009 r. W skrócie, technika ta opiera się na wykorzystaniu nieswoistej endo - egzonukleazy nukleazy mikrokokowej , enzym pochodzący z bakterii Staphylococcus aureus , do wiązania i rozszczepiania niezwiązanych z białkami regionów DNA na chromatynie . DNA związane z histonami lub innymi białkami związanymi z chromatyną (np. czynnikami transkrypcyjnymi ) może pozostać niestrawione. Nieprzecięty DNA jest następnie oczyszczany z białek i sekwencjonowany za pomocą jednej lub więcej różnych sekwencjonowania nowej generacji .
MNase-seq jest jedną z czterech klas metod stosowanych do oceny stanu epigenomu poprzez analizę dostępności chromatyny. Pozostałe trzy techniki to DNaza-seq , FAIRE-seq i ATAC-seq . Podczas gdy sekwencja MNazy jest używana głównie do sekwencjonowania regionów DNA związanych przez histony lub inne białka związane z chromatyną, pozostałe trzy są powszechnie używane do: mapowania miejsc nadwrażliwości na dezoksyrybonukleazę I (DHS) , sekwencjonowania DNA niezwiązanego z białkami chromatyny lub regionów sekwencjonowania luźno upakowanej chromatyny poprzez transpozycję odpowiednio znaczników.
Historia
Nukleaza mikrokokowa (MNaza) została po raz pierwszy odkryta w S. aureus w 1956 r., Białko skrystalizowało w 1966 r. I scharakteryzowane w 1967 r. Trawienie chromatyny MNazą było kluczem do wczesnych badań struktury chromatyny; używany do określenia, że każda jednostka nukleosomalna chromatyny składa się z około 200 pz DNA. To, obok modelu „koralików na sznurku” Olinsa i Olinsa , potwierdzało model Kornberga pomysły dotyczące podstawowej struktury chromatyny. Po dodatkowych badaniach stwierdzono, że MNaza nie może degradować DNA związanego z histonami krótszego niż ~ 140 pz, a DNaza I i II mogą degradować związany DNA do zaledwie 10 pz. To ostatecznie wyjaśniło, że około 146 pz DNA owija się wokół rdzenia nukleosomu, około 50 pz łącznika DNA łączy każdy nukleosom i że 10 ciągłych par zasad DNA ściśle wiąże się z rdzeniem nukleosomu w odstępach.
Oprócz wykorzystania do badania struktury chromatyny, trawienie nukleazą mikrokokową było stosowane w eksperymentach sekwencjonowania oligonukleotydów od czasu jego scharakteryzowania w 1967 r. Trawienie MNazą zostało dodatkowo wykorzystane w kilku badaniach do analizy sekwencji wolnych od chromatyny, takich jak mitochondrialne DNA drożdży ( Saccharomyces cerevisiae ) . a także DNA bakteriofaga poprzez preferencyjne trawienie adeniny i tyminy -bogate regiony We wczesnych latach 80-tych trawienie MNazą stosowano między innymi do określenia fazy nukleosomalnej i powiązanego DNA dla chromosomów z dojrzałego SV40 , muszek owocowych ( Drosophila melanogaster ) , drożdży i małp. Pierwsze badanie, w którym wykorzystano to trawienie do zbadania znaczenia dostępności chromatyny dla ekspresji genów u ludzi, przeprowadzono w 1985 r. W tym badaniu nukleazę wykorzystano do znalezienia powiązania pewnych onkogennych sekwencje z chromatyną i białkami jądrowymi. Badania wykorzystujące trawienie MNazą do określania pozycjonowania nukleosomów bez sekwencjonowania lub informacji o macierzy były kontynuowane na początku XXI wieku.
Wraz z pojawieniem się sekwencjonowania całego genomu pod koniec lat 90. i na początku XXI wieku stało się możliwe porównanie oczyszczonych sekwencji DNA z genomami eukariotycznymi S. cerevisiae, Caenorhabditis elegans , D. melanogaster, Arabidopsis thaliana , Mus musculus i Homo sapiens . Trawienie MNazą zostało po raz pierwszy zastosowane do badań zajętości nukleosomów w całym genomie w S. cerevisiae, którym towarzyszyły analizy za pomocą mikromacierzy w celu określenia, które regiony DNA zostały wzbogacone o nukleosomy oporne na MNazę. Analizy mikromacierzy oparte na MNazie były często wykorzystywane w skali całego genomu dla drożdży i w ograniczonych regionach genomu u ludzi w celu określenia pozycjonowania nukleosomów, które można wykorzystać jako wnioskowanie o inaktywacji transkrypcji .
W 2006 roku po raz pierwszy połączono sekwencjonowanie nowej generacji z trawieniem MNazą w celu zbadania pozycjonowania nukleosomów i preferencji sekwencji DNA u C. elegans, . Był to pierwszy przykład MNazy-seq w jakimkolwiek organizmie.
Dopiero w 2008 r., mniej więcej w czasie, gdy sekwencjonowanie nowej generacji stało się szerzej dostępne, połączono trawienie MNazą z wysokowydajnym sekwencjonowaniem, a mianowicie sekwencjonowaniem Solexa / Illumina , w celu zbadania pozycjonowania nukleosomów w skali całego genomu u ludzi. Rok później ostatecznie ukuto terminy „MNase-Seq” i „MNase-ChIP” dla trawienia nukleazą mikrokokową za pomocą immunoprecypitacji chromatyny . Od pierwszego zastosowania w 2006 r. MNase-seq jest wykorzystywana do głębokiego sekwencjonowania DNA związanego z zajęciem nukleosomów i epigenomiką przez eukarionty. Od lutego 2020 r. MNase-seq jest nadal stosowana do oznaczania dostępności chromatyny.
Opis
Chromatyna jest dynamiczna, a pozycjonowanie nukleosomów na DNA zmienia się poprzez aktywność różnych czynników transkrypcyjnych i kompleksów przebudowujących , w przybliżeniu odzwierciedlając aktywność transkrypcyjną w tych miejscach. DNA owinięte wokół nukleosomów jest generalnie niedostępne dla czynników transkrypcyjnych. W związku z tym MNase-seq można wykorzystać do pośredniego określenia, które regiony DNA są niedostępne transkrypcyjnie, poprzez bezpośrednie określenie, które regiony są związane z nukleosomami.
W typowym eksperymencie MNase-seq jądra komórek eukariotycznych są najpierw izolowane z tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. Następnie MNase-seq wykorzystuje nukleazę mikrokokową endo-egzonukleazy do wiązania i rozszczepiania niezwiązanych z białkami regionów DNA chromatyny eukariotycznej, najpierw rozszczepiając i wycinając jedną nić, a następnie rozszczepiając również nić antyrównoległą. Chromatynę można ewentualnie usieciować formaldehydem . MNaza wymaga Ca 2+ jako kofaktora , zazwyczaj o końcowym stężeniu 1 mM. Jeśli region DNA jest związany przez rdzeń nukleosomu (tj. histony ) lub inne białka związane z chromatyną (np. czynniki transkrypcyjne), wtedy MNaza nie jest w stanie związać i rozszczepić DNA. Nukleosomy lub kompleksy DNA-białko można oczyścić z próbki, a związane DNA można następnie oczyścić za pomocą elektroforezy żelowej i ekstrakcji . Oczyszczony DNA ma typowo ~150 bp, jeśli jest oczyszczony z nukleosomów, lub krótszy, jeśli pochodzi z innego białka (np. czynników transkrypcyjnych). To sprawia, że sekwencjonowanie z krótkim odczytem i dużą przepustowością idealny dla MNase-seq, ponieważ odczyty dla tych technologii są bardzo dokładne, ale mogą obejmować tylko kilkaset ciągłych par zasad. Po zsekwencjonowaniu odczyty można dopasować do genomu odniesienia , aby określić, które regiony DNA są związane przez interesujące nukleosomy lub białka, za pomocą narzędzi takich jak Bowtie . Pozycjonowanie nukleosomów wyjaśnione za pomocą MNase-seq można następnie wykorzystać do przewidywania ekspresji genomowej i regulacji w czasie trawienia.
Techniki rozszerzone
MNase-ChIP/ CUT&RUN
Ostatnio MNaza-seq została również wdrożona do określania, gdzie czynniki transkrypcyjne wiążą się z DNA. Klasyczny ChIP-seq wyświetla problemy z jakością rozdzielczości, rygorystycznością protokołu eksperymentalnego i fragmentacją DNA . Klasyczny ChIP-seq zazwyczaj wykorzystuje sonikację do fragmentacji chromatyny , która odchyla regiony heterochromatyczne z powodu skondensowanego i ścisłego wiązania regionów chromatyny ze sobą. W przeciwieństwie do histonów , czynniki transkrypcyjne tylko przejściowo wiążą DNA. Inne metody, takie jak sonikacja w ChIP-seq, wymagające użycia podwyższonych temperatur i detergentów, mogą prowadzić do utraty czynnika. Sekwencjonowanie CUT&RUN jest nową formą immunoprecypitacji opartej na MNazie . W skrócie, wykorzystuje MNazę znakowaną przeciwciałem do swoistego wiązania białek związanych z DNA, które prezentują epitop rozpoznawane przez to przeciwciało. Następnie trawienie zachodzi specyficznie w regionach otaczających ten czynnik transkrypcyjny, umożliwiając dyfuzję tego kompleksu z jądra i uzyskanie go bez martwienia się o znaczące tło ani komplikacje związane z sonikacją. Zastosowanie tej techniki nie wymaga wysokich temperatur ani wysokich stężeń detergentu. Ponadto MNaza poprawia trawienie chromatyny dzięki aktywności egzonukleazy i endonukleazy. Komórki poddaje się lizie w SDS / Triton X-100 rozwiązanie. Następnie dodaje się kompleks MNaza-przeciwciało. I wreszcie, kompleks białko-DNA można wyizolować, a następnie DNA oczyścić i zsekwencjonować . Otrzymany rozpuszczalny ekstrakt zawiera 25-krotne wzbogacenie we fragmenty poniżej 50 bp. To zwiększone wzbogacenie skutkuje ekonomicznymi danymi o wysokiej rozdzielczości.
Jednokomórkowa sekwencja MNazy
Sekwencjonowanie jednokomórkowej nukleazy mikrokokowej (scMNase-seq) to nowa technika używana do analizy pozycjonowania nukleosomów i wnioskowania o dostępności chromatyny przy użyciu tylko danych wejściowych z jednej komórki. Najpierw komórki są sortowane na pojedyncze porcje przy użyciu sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) . Komórki są następnie lizowane i trawione nukleazą mikrokokową. Wyizolowany DNA poddawany jest PCR , a następnie izolowana i analizowana jest pożądana sekwencja. Zastosowanie MNazy w testach jednokomórkowych skutkuje zwiększoną wykrywalnością regionów, takich jak miejsca nadwrażliwości na DNazę I jak również miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych.
Porównanie z innymi testami dostępności chromatyny
MNase-seq jest jedną z czterech głównych metod ( DNase-seq , MNase-seq, FAIRE-seq i ATAC-seq ) do bardziej bezpośredniego określania dostępności chromatyny i późniejszych konsekwencji dla ekspresji genów . Wszystkie cztery techniki kontrastuje z ChIP-seq , która opiera się na wnioskowaniu, że pewne znaki na ogonach histonów wskazują na aktywację lub represję genów, nie oceniając bezpośrednio pozycjonowania nukleosomów, ale zamiast tego są cenne dla oceny funkcji enzymatycznej modyfikatora histonów.
sekwencja DNazy
Podobnie jak w przypadku MNase-seq, DNaza-seq została opracowana przez połączenie istniejącej endonukleazy DNA z technologią sekwencjonowania nowej generacji w celu oceny dostępności chromatyny. Obie techniki zostały zastosowane u kilku eukariontów w celu ustalenia informacji o położeniu nukleosomów w odpowiednich organizmach i obie opierają się na tej samej zasadzie trawienia otwartego DNA w celu wyizolowania prążków DNA ~ 140 bp z nukleosomów lub krótszych prążków w przypadku ustalenia informacji o czynnikach transkrypcyjnych. Obie techniki zostały ostatnio zoptymalizowane pod kątem sekwencjonowania pojedynczych komórek, co koryguje jedną z głównych wad obu technik; jest to wymóg dla wysokiego wkładu komórki.
W wystarczających stężeniach DNaza I jest zdolna do trawienia DNA związanego z nukleosomem do 10 pz, podczas gdy nukleaza mikrokokowa nie. Dodatkowo DNaza-seq służy do identyfikacji DHS, które są regionami DNA, które są nadwrażliwe na traktowanie DNazą i często wskazują na regiony regulatorowe (np. promotory lub wzmacniacze ). Równoważnego efektu nie znaleziono w przypadku MNazy. W wyniku tego rozróżnienia, DNaza-seq jest wykorzystywana przede wszystkim do bezpośredniej identyfikacji regionów regulatorowych, podczas gdy MNaza-seq służy do identyfikacji czynnika transkrypcyjnego i zajętości nukleosomów w celu pośredniego wnioskowania o wpływie na ekspresję genów.
FAIRE-nast
FAIRE-seq różni się bardziej od MNase-seq niż DNaza-seq. FAIRE-seq został opracowany w 2007 roku i trzy lata później połączony z sekwencjonowaniem nowej generacji w celu zbadania DHS. FAIRE-seq opiera się na zastosowaniu formaldehydu do sieciowania docelowych białek z DNA, a następnie sonikacji i ekstrakcji fenolem-chloroformem w celu oddzielenia nieusieciowanego DNA i usieciowanego DNA. Nieusieciowany DNA jest sekwencjonowany i analizowany, co pozwala na bezpośrednią obserwację otwartej chromatyny.
MNase-seq nie mierzy dostępności chromatyny tak bezpośrednio jak FAIRE-seq. Jednak w przeciwieństwie do FAIRE-seq, niekoniecznie wymaga sieciowania ani nie polega na sonikacji, ale może wymagać ekstrakcji fenolem i chloroformem . Dwie główne wady FAIRE-seq, w porównaniu z pozostałymi trzema klasami, to minimalny wymagany wkład wynoszący 100 000 komórek i zależność od sieciowania. Sieciowanie może wiązać inne białka związane z chromatyną, które przejściowo oddziałują z DNA, ograniczając w ten sposób ilość nieusieciowanego DNA, który można odzyskać i zbadać z fazy wodnej. W związku z tym ogólna rozdzielczość uzyskana z FAIRE-seq może być stosunkowo niższa niż rozdzielczość DNazy-seq lub MNazy-seq, a przy wymogu 100 000 komórek jednokomórkowe odpowiedniki DNazy-seq lub MNazy-seq czynią je znacznie bardziej atrakcyjnymi alternatywami .
Sekw. ATAC
ATAC-seq to ostatnio opracowana klasa testów dostępności chromatyny. ATAC-seq wykorzystuje hiperaktywną transpozazę do wstawiania markerów transpozycyjnych ze specyficznymi adapterami, zdolnymi do wiązania starterów do sekwencjonowania, do otwartych regionów chromatyny. PCR można następnie zastosować do amplifikacji sekwencji przylegających do wstawionych transpozonów, umożliwiając określenie otwartych sekwencji chromatyny bez powodowania przesunięcia w strukturze chromatyny. Udowodniono, że ATAC-seq jest skuteczny u ludzi, wśród innych eukariontów, w tym w zamrożonych próbkach. Podobnie jak w przypadku DNazy-seq i MNase-seq, opracowano również udaną jednokomórkową wersję ATAC-seq.
ATAC-seq ma kilka zalet w porównaniu z MNase-seq w ocenie dostępności chromatyny. ATAC-seq nie opiera się na zmiennym trawieniu nukleazy mikrokokowej ani na sieciowaniu lub ekstrakcji fenolowo-chloroformowej. Ogólnie zachowuje strukturę chromatyny, więc wyniki z ATAC-seq mogą być wykorzystane do bezpośredniej oceny dostępności chromatyny, a nie pośrednio przez MNase-seq. ATAC-seq można również ukończyć w ciągu kilku godzin, podczas gdy pozostałe trzy techniki zazwyczaj wymagają całonocnych okresów inkubacji. Dwie główne wady ATAC-seq, w porównaniu z MNase-seq, to wymóg większego pokrycia sekwencjonowaniem i występowanie zanieczyszczenia mitochondrialnego z powodu niespecyficznej insercji DNA zarówno do DNA mitochondrialnego, jak i jądrowego. Pomimo tych drobnych wad, stosowanie ATAC-seq zamiast alternatyw staje się coraz bardziej powszechne.