Sekwencjonowanie CUT&RUN

Sekwencjonowanie CUT&RUN , znane również jako cięcie pod celami i uwalnianie za pomocą nukleazy , jest metodą stosowaną do analizy interakcji białek z DNA . Sekwencjonowanie CUT&RUN łączy ukierunkowane na przeciwciała, kontrolowane cięcie przez nukleazę mikrokokową z masowo równoległym sekwencjonowaniem DNA w celu identyfikacji miejsc wiązania białek związanych z DNA. Można go użyć do precyzyjnego mapowania globalnych miejsc wiązania DNA dla dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Obecnie ChIP-Seq jest najpowszechniejszą techniką wykorzystywaną do badania relacji białko-DNA, jednak ma szereg praktycznych i ekonomicznych ograniczeń, których nie ma sekwencjonowanie CUT&RUN.

Używa

Sekwencjonowanie CUT&RUN można wykorzystać do badania regulacji genów lub analizy czynnika transkrypcyjnego i innych białek związanych z chromatyną. Interakcje białko-DNA regulują ekspresję genów i są odpowiedzialne za wiele procesów biologicznych i stanów chorobowych. Ta epigenetyczna jest uzupełnieniem analizy genotypu i ekspresji. CUT&RUN to alternatywa dla obecnego standardu ChIP-seq . ChIP-Seq ma ograniczenia wynikające z etapu sieciowania w protokołach ChIP-Seq, który może promować maskowanie epitopów i generować fałszywie dodatnie miejsca wiązania. ChIP-seq ma również nieoptymalny stosunek sygnału do szumu i słabą rozdzielczość. Sekwencjonowanie CUT&RUN ma tę zaletę, że jest prostszą techniką o niższych kosztach ze względu na wysoki stosunek sygnału do szumu, wymagając mniejszej głębokości sekwencjonowania.

Specyficzne miejsca DNA w bezpośredniej interakcji fizycznej z białkami, takimi jak czynniki transkrypcyjne, można wyizolować za pomocą sprzężonej z białkiem A (pA) nukleazy mikrokokowej (MNazy) związanej z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Cięcie, w którym pośredniczy MNaza, tworzy bibliotekę docelowych miejsc DNA związanych z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania in situ . Sekwencjonowanie przygotowanych bibliotek DNA i porównanie z bazami danych sekwencji całego genomu pozwala naukowcom analizować interakcje między białkami docelowymi a DNA, a także różnice w epigenetycznych modyfikacjach chromatyny . Dlatego metodę CUT&RUN można zastosować do białek i modyfikacji, w tym czynników transkrypcyjnych , polimeraz , białek strukturalnych , modyfikacji białek i modyfikacji DNA.

Przepływ pracy

Wizualna reprezentacja przepływu pracy sekwencjonowania CUT&RUN

CUT&RUN to adaptacja i ulepszenie endogennego cięcia chromatyny (ChEC), które wykorzystuje białko wiążące DNA genetycznie połączone z nukleazą mikrokokową (MNaza). Te białka fuzyjne czynnik transkrypcyjny-MNaza mogą rozszczepiać DNA wokół miejsca wiązania DNA białka będącego przedmiotem zainteresowania. W dostosowanym procesie oczyszczona MNaza jest znakowana białkiem A (pA), które celuje w przeciwciało, które zostało dodane do komórki i jest specyficzne dla białka wiążącego DNA, które jest przedmiotem zainteresowania. Istnieje siedem ogólnych kroków procesu CUT&RUN.

Rozszczepianie pod celami i uwalnianie za pomocą nukleazy

Pierwszym wymaganym krokiem jest hipotoniczna liza komórek będących przedmiotem zainteresowania w celu wyizolowania jąder. Jądra następnie odwirowuje się, przemywa roztworem buforowym, kompleksuje z lektyną . Kompleks lektyna-jądro jest następnie ponownie zawieszany z przeciwciałem ukierunkowanym na białko będące przedmiotem zainteresowania. Przeciwciało i jądra są następnie inkubowane w buforze przez około 2 godziny przed przemyciem jąder w buforze w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał. Następnie jądra ponownie zawiesza się w buforze z Protein-A-MNazą i inkubuje przez 1 godzinę. Jądra następnie ponownie przemywa się buforem w celu usunięcia niezwiązanej białka-A-MNazy. Następnie jądra w probówkach umieszcza się w metalowym bloku i umieszcza w lodowatej wodzie i dodaje CaCL2 w celu zainicjowania zależnej od wapnia aktywności nukleazy MNazy w celu rozszczepienia DNA wokół białka wiążącego DNA . Reakcję białka-A-MNazy przerywa się przez dodanie środków chelatujących ( EDTA i EGTA). Rozszczepione fragmenty DNA są następnie uwalniane do supernatantu przez inkubację jąder przez godzinę przed osadzeniem jąder przez wirowanie. Fragmenty DNA są następnie ekstrahowane z supernatantu i mogą być użyte do skonstruowania biblioteki sekwencjonowania.

Sekwencjonowanie

W przeciwieństwie do ChIP-Seq nie jest wymagany wybór rozmiaru przed sekwencjonowaniem. Pojedynczy przebieg sekwencjonowania może skanować w poszukiwaniu asocjacji obejmujących cały genom z wysoką rozdzielczością, ze względu na niskie tło uzyskane dzięki przeprowadzeniu reakcji in situ za pomocą metodologii sekwencjonowania CUT&RUN. Natomiast ChIP-Seq wymaga dziesięciokrotnie większej głębokości sekwencjonowania ze względu na samoistnie wysokie tło związane z tą metodą. Dane są następnie gromadzone i analizowane za pomocą oprogramowania, które dopasowuje sekwencje próbek do znanej sekwencji genomowej w celu identyfikacji fragmentów DNA CUT&RUN.

Protokoły

W ogólnodostępnym repozytorium metod dostępne są szczegółowe przepływy pracy CUT&RUN.

Wrażliwość

Sekwencjonowanie CUT&RUN zapewnia niski poziom sygnału tła dzięki profilowaniu in situ , które zachowuje potwierdzenia in vivo 3D interakcji czynnik transkrypcyjny-DNA, dzięki czemu przeciwciała mają dostęp tylko do odsłoniętych powierzchni. Czułość sekwencjonowania zależy od głębokości przebiegu sekwencjonowania (tj. liczby zmapowanych znaczników sekwencji), wielkości genomu i rozmieszczenia czynnika docelowego. Głębokość sekwencjonowania jest bezpośrednio skorelowana z kosztem i ujemnie skorelowana z tłem. Dlatego sekwencjonowanie CUT&RUN z niskim tłem jest z natury bardziej opłacalne niż sekwencjonowanie ChIP z wysokim tłem.

Reprezentacja wywołań szczytowych dla ukierunkowanych wyników sekwencjonowania H3K27me3 , porównując CUT&RUN z tradycyjnym ChIP. Tutaj CUT&RUN wydaje się zapewniać lepszy stosunek sygnału do szumu niż tradycyjny układ ChIP. Ta zaleta przekłada się na niższe koszty sekwencjonowania.

Obecne badania

Powstało już wiele projektów badawczych wykorzystujących nową technologię CUT&RUN.

U ludzi badacze zajmujący się promotorami genów globiny płodowej wykorzystali CUT&RUN do zbadania udziału białka BCL11A w pośredniczeniu w funkcji regionu genu HBBP1, podkreślając potencjalny cel terapeutycznej edycji genomu dla hemoglobinopatii .

Grupa badawcza wykorzystała CUT&RUN do zidentyfikowania półproduktów zaangażowanych w rozrywanie nukleosomów podczas transkrypcji DNA, potwierdzając ogólną strategię epigenomiki strukturalnej .

U ludzi i afrykańskich małp zielonych naukowcy stosujący CUT&RUN ustalili, że białko CENP-B (ważne białko w tworzeniu centromeru) i miejsca wiązania są specyficzne dla centromerów małp człekokształtnych, zajmując się paradoksem, że CENP-B, który jest wymagany do sztucznego centromeru funkcja nie jest istotna.

Analiza obliczeniowa

Podobnie jak w przypadku wielu podejść do sekwencjonowania o dużej przepustowości, CUT&RUN-seq generuje bardzo duże zbiory danych, dla których wymagane są odpowiednie metody analizy obliczeniowej. Aby przewidzieć miejsca wiązania DNA na podstawie danych o liczbie odczytów CUT&RUN-seq, opracowano metody wywoływania pików .

Wywoływanie szczytów to proces, w którym algorytm jest używany do przewidywania regionów genomu, z którymi wiąże się czynnik transkrypcyjny, poprzez znajdowanie regionów genomu, które mają wiele zmapowanych odczytów z eksperymentu ChIP-seq lub CUT&RUN-seq. MACS jest szczególnie popularnym algorytmem wyznaczania wartości szczytowych dla danych ChIP-seq. SEACR to wysoce selektywny program wywołujący piki, który definitywnie potwierdza dokładność CUT&RUN dla zestawów danych ze znanymi prawdziwymi negatywami.

Aby zidentyfikować przyczynowy motyw wiążący DNA dla wywołań pików CUT&RUN-seq, można zastosować program do wyszukiwania motywów MEME do sekwencji CUT&RUN. Obejmuje to użycie macierzy punktacji specyficznej dla pozycji (PSSM) wraz z narzędziem do wyrównywania i wyszukiwania motywów (MAST) w celu zidentyfikowania motywów w genomie referencyjnym, które pasują do uzyskanych odczytów sekwencji. Ten proces pozwala na identyfikację motywu wiążącego czynnik transkrypcyjny lub, jeśli motyw wiążący był wcześniej znany, proces ten może potwierdzić powodzenie eksperymentu

Ograniczenia

Podstawowym ograniczeniem CUT&RUN-seq jest prawdopodobieństwo nadmiernego trawienia DNA z powodu niewłaściwego czasu reakcji MNazy zależnej od wapnia. Podobne ograniczenie istnieje dla współczesnych protokołów ChIP-Seq, w których należy zoptymalizować ścinanie enzymatyczne lub sonikowane DNA. Podobnie jak w przypadku ChIP-Seq , wymagane jest dobrej jakości przeciwciało ukierunkowane na białko będące przedmiotem zainteresowania.

Podobne metody

  • Sono-Seq : Identyczny z ChIP-Seq, ale bez etapu immunoprecypitacji.
  • HITS-CLIP : Nazywany również CLIP-Seq , używany do wykrywania interakcji z RNA , a nie z DNA.
  • PAR-CLIP : Metoda identyfikacji miejsc wiązania komórkowych białek wiążących RNA .
  • RIP-Chip : podobny do ChIP-Seq, ale nie wykorzystuje metod sieciowania i wykorzystuje analizę mikromacierzy zamiast sekwencjonowania.
  • SELEX : Stosowany do określenia konsensusowych sekwencji wiążących.
  • Konkurencja-ChIP : Mierzy względną dynamikę zastępowania DNA.
  • ChiRP-Seq : Mierzy DNA i białka związane z RNA.
  • ChIP-exo : Wykorzystuje obróbkę egzonukleazą w celu uzyskania rozdzielczości do pojedynczej pary zasad
  • ChIP-nexus: Potencjalna poprawa w stosunku do ChIP-exo , zdolna do osiągnięcia rozdzielczości do pojedynczej pary zasad.
  • DRIP-seq : Wykorzystuje przeciwciało S9.6 do wytrącania trójniciowych hybryd DND:RNA zwanych pętlami R.
  • TCP-seq : Zasadniczo podobna metoda pomiaru dynamiki translacji mRNA.
  • DamID : Wykorzystuje wzbogacenie metylowanych sekwencji DNA w celu wykrycia interakcji białko-DNA bez obecności przeciwciał.

Zobacz też

Pobrano z „ https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=CUT%26RUN_sequencing&oldid=1092819693 ”