Sekwencjonowanie CUT&Tag

Sekwencjonowanie CUT&Tag , znane również jako cięcie pod celami i znakowanie , jest metodą stosowaną do analizy interakcji białek z DNA . Sekwencjonowanie CUT&Tag łączy kontrolowane cięcie ukierunkowane na przeciwciała przez fuzję białka A - Tn5 z masowo równoległym sekwencjonowaniem DNA w celu identyfikacji miejsc wiązania białek związanych z DNA. Można go użyć do precyzyjnego mapowania globalnych miejsc wiązania DNA dla dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Obecnie ChIP-Seq jest najpowszechniejszą techniką wykorzystywaną do badania relacji białko-DNA, jednak ma szereg praktycznych i ekonomicznych ograniczeń, których nie ma sekwencjonowanie CUT&RUN i CUT&Tag. Sekwencjonowanie CUT&Tag jest ulepszeniem w stosunku do CUT&RUN , ponieważ nie wymaga lizy komórek ani frakcjonowania chromatyny. CUT&RUN nie nadaje się do platform z pojedynczą komórką, więc CUT&Tag jest dla nich korzystny.

Używa

Sekwencjonowanie CUT&Tag można wykorzystać do badania regulacji genów lub analizy czynnika transkrypcyjnego i innych białek związanych z chromatyną. Interakcje białko-DNA regulują ekspresję genów i są odpowiedzialne za wiele procesów biologicznych i stanów chorobowych. Ta epigenetyczna jest uzupełnieniem analizy genotypu i ekspresji. CUT&Tag jest alternatywą dla obecnego standardu ChIP-seq . ChIP-Seq ma ograniczenia wynikające z etapu sieciowania w protokołach ChIP-Seq, który może promować maskowanie epitopów i generować fałszywie dodatnie miejsca wiązania. ChIP-seq ma również nieoptymalny stosunek sygnału do szumu i słabą rozdzielczość. CUT&Run-sekwencjonowanie i CUT&Tag mają tę zaletę, że są prostszymi technikami o niższych kosztach ze względu na wysoki stosunek sygnału do szumu, co wymaga mniejszej głębokości sekwencjonowania.

Specyficzne miejsca DNA w bezpośredniej interakcji fizycznej z białkami, takimi jak czynniki transkrypcyjne, można wyizolować przez Tn5 skoniugowany z białkiem A (pA) związany z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Cięcie, w którym pośredniczy Tn5, tworzy bibliotekę docelowych miejsc DNA związanych in situ z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania . Sekwencjonowanie przygotowanych bibliotek DNA i porównanie z bazami danych sekwencji całego genomu pozwala naukowcom analizować interakcje między białkami docelowymi a DNA, a także różnice w epigenetycznych modyfikacjach chromatyny . Dlatego metodę CUT&Tag można zastosować do białek i modyfikacji, w tym czynników transkrypcyjnych , polimeraz , białek strukturalnych , modyfikacji białek i modyfikacji DNA.

Sekwencjonowanie

W przeciwieństwie do ChIP-Seq nie jest wymagany wybór rozmiaru przed sekwencjonowaniem. Pojedynczy przebieg sekwencjonowania może skanować w poszukiwaniu asocjacji obejmujących cały genom z wysoką rozdzielczością, ze względu na niskie tło uzyskane dzięki przeprowadzeniu reakcji in situ za pomocą metodologii sekwencjonowania CUT&RUN. Natomiast ChIP-Seq wymaga dziesięciokrotnie większej głębokości sekwencjonowania ze względu na samoistnie wysokie tło związane z tą metodą. Dane są następnie gromadzone i analizowane przy użyciu oprogramowania, które dopasowuje sekwencje próbek do znanej sekwencji genomowej w celu identyfikacji fragmentów DNA CUT&Tag.

Protokoły

W ogólnodostępnym repozytorium metod dostępne są szczegółowe przepływy pracy CUT&Tag.

Wrażliwość

CUT&Run-Sequencing lub CUT&Tag-Sequencing zapewniają niski poziom sygnału tła dzięki profilowaniu in situ , które zachowuje potwierdzenia 3D in vivo interakcji czynnik transkrypcyjny-DNA, dzięki czemu przeciwciała mają dostęp tylko do odsłoniętych powierzchni. Czułość sekwencjonowania zależy od głębokości przebiegu sekwencjonowania (tj. liczby zmapowanych znaczników sekwencji), wielkości genomu i rozmieszczenia czynnika docelowego. Głębokość sekwencjonowania jest bezpośrednio skorelowana z kosztem i ujemnie skorelowana z tłem. Dlatego sekwencjonowanie CUT&Tag z niskim tłem jest z natury bardziej opłacalne niż sekwencjonowanie ChIP z wysokim tłem.

Reprezentacja wywołań szczytowych dla ukierunkowanych wyników sekwencjonowania H3K27me3 , porównując CUT&RUN z tradycyjnym ChIP. Zauważ, że CUT&RUN i CUT&Tag wydają się zapewniać lepszy stosunek sygnału do szumu niż tradycyjny ChIP. Ta zaleta przekłada się na niższe koszty sekwencjonowania (i wykonalność w pojedynczych komórkach dla CUT&Tag).

Ograniczenia

Podstawowym ograniczeniem CUT&Tag-seq jest prawdopodobieństwo nadmiernego trawienia DNA z powodu niewłaściwego czasu reakcji Tn5 zależnej od magnezu. Podobne ograniczenie istnieje dla współczesnych protokołów ChIP-Seq, w których należy zoptymalizować ścinanie enzymatyczne lub sonikowane DNA. Podobnie jak w przypadku ChIP-Seq , wymagane jest dobrej jakości przeciwciało ukierunkowane na białko będące przedmiotem zainteresowania. Podobnie jak w przypadku innych technik wykorzystujących Tn5, preparat biblioteki ma silne obciążenie GC i ma słabą czułość w regionach o niskim GC lub genomach o dużej zmienności zawartości GC.

Podobne metody

Sono-Seq : Identyczny z ChIP-Seq, ale bez etapu immunoprecypitacji.
HITS-CLIP : Nazywany również CLIP-Seq , używany do wykrywania interakcji z RNA , a nie z DNA.
PAR-CLIP : Metoda identyfikacji miejsc wiązania komórkowych białek wiążących RNA .
RIP-Chip : podobny do ChIP-Seq, ale nie wykorzystuje metod sieciowania i wykorzystuje analizę mikromacierzy zamiast sekwencjonowania.
SELEX : Stosowany do określenia konsensusowych sekwencji wiążących.
Konkurencja-ChIP : Mierzy względną dynamikę zastępowania DNA.
ChiRP-Seq : Mierzy DNA i białka związane z RNA.
ChIP-exo : Wykorzystuje obróbkę egzonukleazą w celu uzyskania rozdzielczości do pojedynczej pary zasad
ChIP-nexus: Potencjalna poprawa w stosunku do ChIP-exo , zdolna do osiągnięcia rozdzielczości do pojedynczej pary zasad.
DRIP-seq : Wykorzystuje przeciwciało S9.6 do wytrącania trójniciowych hybryd DND:RNA zwanych pętlami R.
TCP-seq : Zasadniczo podobna metoda pomiaru dynamiki translacji mRNA.
DamID : Wykorzystuje wzbogacenie metylowanych sekwencji DNA w celu wykrycia interakcji białko-DNA bez obecności przeciwciał.
CUT&RUN : Wykorzystuje białko A-Mnazę

Zobacz też