Sekwencjonowanie ChIL
Sekwencjonowanie ChIL (ChIL-seq), znane również jako sekwencjonowanie znakowania integracji chromatyny , jest metodą stosowaną do analizy interakcji białek z DNA . Sekwencjonowanie ChIL łączy ukierunkowane na przeciwciała, kontrolowane cięcie przez transpozazę Tn5 z masowo równoległym sekwencjonowaniem DNA w celu identyfikacji miejsc wiązania białek związanych z DNA. Można go użyć do precyzyjnego mapowania globalnych miejsc wiązania DNA dla dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Obecnie ChIP-Seq jest najpowszechniejszą techniką wykorzystywaną do badania relacji białko-DNA, jednak ma szereg praktycznych i ekonomicznych ograniczeń, których nie ma sekwencjonowanie ChIL. ChIL-Seq to precyzyjna technika, która zmniejsza utratę próbki, którą można zastosować do pojedynczych komórek.
Używa
Sekwencjonowanie ChIL można wykorzystać do zbadania regulacji genów lub analizy czynnika transkrypcyjnego i innych białek związanych z chromatyną. Interakcje białko-DNA regulują ekspresję genów i są odpowiedzialne za wiele procesów biologicznych i stanów chorobowych. Ta epigenetyczna jest uzupełnieniem analizy genotypu i ekspresji. ChIL-Seq jest alternatywą dla obecnego standardu ChIP-seq . ChIP-Seq ma ograniczenia wynikające z etapu sieciowania w protokołach ChIP-Seq, który może promować maskowanie epitopów i generować fałszywie dodatnie miejsca wiązania. ChIP-seq ma również nieoptymalny stosunek sygnału do szumu i słabą rozdzielczość. Sekwencjonowanie ChIL ma tę zaletę, że jest prostszą techniką odpowiednią dla małych próbek wejściowych ze względu na wysoki stosunek sygnału do szumu, wymagając mniejszej głębokości sekwencjonowania dla wyższej czułości.
Specyficzne miejsca DNA w bezpośredniej fizycznej interakcji z białkami, takimi jak czynniki transkrypcyjne, można wyizolować przez Tn5 skoniugowany z białkiem A (pA) związany z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Cięcie, w którym pośredniczy Tn5, tworzy bibliotekę docelowych miejsc DNA związanych in situ z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania . Sekwencjonowanie przygotowanych bibliotek DNA i porównanie z bazami danych sekwencji całego genomu pozwala naukowcom analizować interakcje między białkami docelowymi a DNA, a także różnice w epigenetycznych modyfikacjach chromatyny . Dlatego metodę ChIL-Seq można zastosować do białek i modyfikacji, w tym czynników transkrypcyjnych , polimeraz , białek strukturalnych , modyfikacji białek i modyfikacji DNA.
Protokoły
W ogólnodostępnym repozytorium metod dostępne są szczegółowe przepływy pracy ChIL-Seq.
Ograniczenia
Podstawowym ograniczeniem ChIL-seq jest prawdopodobieństwo nadmiernego trawienia DNA z powodu niewłaściwego czasu reakcji Tn5 zależnej od magnezu. Jest to ukierunkowane na otwartą chromatynę, taką jak ATAC-Seq i podobne techniki. Podobne ograniczenie istnieje dla współczesnych protokołów ChIP-Seq, w których należy zoptymalizować ścinanie enzymatyczne lub sonikowane DNA. Podobnie jak w przypadku ChIP-Seq , wymagane jest dobrej jakości przeciwciało ukierunkowane na białko będące przedmiotem zainteresowania. Podobnie jak w przypadku innych technik wykorzystujących Tn5, preparat biblioteki ma silne obciążenie GC i ma słabą czułość w regionach o niskim GC lub genomach o dużej zmienności zawartości GC.
ChIL-Seq wymaga wielu etapów laboratoryjnych i trwa dłużej niż inne techniki, takie jak CUT&RUN czy CUT&Tag . Jest to nadal szeroko stosowana technika, która pozwala uniknąć utraty próbki, odpowiednia dla niewielkiej liczby komórek. Jednak koszt materiałów eksploatacyjnych ChIL-Seq jest znacznie niższy, co pozwala na przetworzenie większej liczby próbek.
Podobne metody
- Sono-Seq : Identyczny z ChIP-Seq, ale bez etapu immunoprecypitacji.
- HITS-CLIP : Nazywany również CLIP-Seq , używany do wykrywania interakcji z RNA , a nie z DNA.
- PAR-CLIP : Metoda identyfikacji miejsc wiązania komórkowych białek wiążących RNA .
- RIP-Chip : podobny do ChIP-Seq, ale nie wykorzystuje metod sieciowania i wykorzystuje analizę mikromacierzy zamiast sekwencjonowania.
- SELEX : Stosowany do określenia konsensusowych sekwencji wiążących.
- Konkurencja-ChIP : Mierzy względną dynamikę zastępowania DNA.
- ChiRP-Seq : Mierzy DNA i białka związane z RNA.
- ChIP-exo : Wykorzystuje obróbkę egzonukleazą w celu uzyskania rozdzielczości do pojedynczej pary zasad
- ChIP-nexus: Potencjalna poprawa w stosunku do ChIP-exo , zdolna do osiągnięcia rozdzielczości do pojedynczej pary zasad.
- DRIP-seq : Wykorzystuje przeciwciało S9.6 do wytrącania trójniciowych hybryd DND:RNA zwanych pętlami R.
- TCP-seq : Zasadniczo podobna metoda pomiaru dynamiki translacji mRNA.
- DamID : Wykorzystuje wzbogacenie metylowanych sekwencji DNA w celu wykrycia interakcji białko-DNA bez obecności przeciwciał.