Test kwasu bicynchoniowego
Test kwasu bicynchoninowego ( test BCA ), znany również jako test Smitha , na cześć jego wynalazcy, Paula K. Smitha z firmy Pierce Chemical Company , obecnie będącej częścią firmy Thermo Fisher Scientific, jest testem biochemicznym służącym do określania całkowitego stężenia białka w roztwór (0,5 μg/mL do 1,5 mg/mL), podobny do testu Lowry'ego , Bradforda lub odczynnika biuretowego . Całkowite stężenie białka jest wykazywane przez zmianę koloru roztworu próbki z zielonego na fioletowy proporcjonalnie do stężenia białka, które można następnie zmierzyć za pomocą technik kolorymetrycznych .
Mechanizm
Podstawowy roztwór BCA zawiera następujące składniki w wysoce alkalicznym roztworze o pH 11,25: kwas bicynchoniowy , węglan sodu , wodorowęglan sodu , winian sodu i pentahydrat siarczanu miedzi (II) .
Test BCA opiera się głównie na dwóch reakcjach. Po pierwsze, wiązania peptydowe w białku redukują jony Cu 2+ z siarczanu miedzi(II) do Cu 1+ (reakcja zależna od temperatury). Ilość zredukowanej Cu 2+ jest proporcjonalna do ilości białka obecnego w roztworze. Następnie dwie cząsteczki kwasu bicynchoninowego chelatują z każdym jonem Cu 1+ , tworząc purpurowy kompleks silnie absorbujący światło o długości fali 562 nm .
kwasu bicynchoniowego Cu 1+ wpływa w próbkach białek obecność łańcuchów bocznych cysteiny/cystyny, tyrozyny i tryptofanu. W wyższych temperaturach (37 do 60 ° C) wiązania peptydowe pomagają w tworzeniu kompleksu reakcyjnego. Inkubacja testu BCA w wyższych temperaturach jest zalecana jako sposób na zwiększenie czułości testu przy jednoczesnej minimalizacji odchyleń spowodowanych nierównym składem aminokwasów.
Ilość białka obecnego w roztworze można określić ilościowo, mierząc widma absorpcji i porównując je z roztworami białek o znanym stężeniu.
Zobacz też
- Wiechelman K.; Braun, R. & Fitzpatrick, J. (1988). „Badanie testu białka kwasu bicynchoniowego: identyfikacja grup odpowiedzialnych za tworzenie koloru”. Analny. Biochem . 175 (1): 231-7. doi : 10.1016/0003-2697(88)90383-1 . PMID 3245570 .
- Stoszczek, CM. (1990). „Ilościowe oznaczenie białka”. Metody w enzymologii . 182 : 50–69. doi : 10.1016/0076-6879(90)82008-P . ISBN 9780121820831 . PMID 2314256 .