Test biuretowy

Charakterystyczny kolor pozytywnego testu biuretowego

W chemii test biureta (IPA: / test ˌ b aɪ j ə r ɛ t / , / do b aɪ j ə ˌ r ɛ t / ), znany również jako Piotrowskiego , jest testem chemicznym stosowanym wykrywania obecności co najmniej dwa wiązania peptydowe w cząsteczce. W obecności peptydów jon miedzi (II) tworzy w roztworze alkalicznym fioletowo zabarwione kompleksy koordynacyjne . Reakcję po raz pierwszy zaobserwowano w 1833 roku; W Polsce test biuretowy jest również znany jako test Piotrowskiego na cześć polskiego fizjologa Gustawa Piotrowskiego , który niezależnie odkrył go ponownie w 1857 r. Opracowano kilka wariantów testu, takich jak test BCA i Zmodyfikowany test Lowry'ego.

Reakcję biuretową można wykorzystać do oceny stężenia białek, ponieważ wiązania peptydowe występują z taką samą częstotliwością na aminokwas w peptydzie. Intensywność koloru, a tym samym absorpcja przy 540 nm, jest wprost proporcjonalna do stężenia białka, zgodnie z prawem Beera-Lamberta .

Pomimo swojej nazwy odczynnik w rzeczywistości nie zawiera biuretu [(H ₂ N-CO-) ₂ NH] . Test został tak nazwany, ponieważ daje również pozytywną reakcję na wiązania peptydopodobne w cząsteczce biuretu.

W tym teście miedź(II) wiąże się z atomami azotu obecnymi w peptydach białek. W reakcji wtórnej miedź(II) ulega redukcji do miedzi(I). Bufory, takie jak Tris i amoniak, zakłócają ten test, przez co test ten jest nieodpowiedni dla próbek białek oczyszczonych z wytrącania siarczanem amonu. Ze względu na swoją niewrażliwość i niewielką ingerencję wolnych aminokwasów, test ten jest najbardziej przydatny do próbek całych tkanek i innych źródeł o wysokim stężeniu białka.

Procedura

Próbkę wodną traktuje się równą objętością 1% mocnej zasady (wodorotlenku sodu lub potasu), a następnie kilkoma kroplami wodnego roztworu siarczanu miedzi (II) . Jeśli roztwór zmieni kolor na fioletowy, oznacza to, że zawiera białko. Można oznaczyć 5–160 mg/ ml . Peptydy o prawidłowej długości co najmniej 3 aminokwasów są niezbędne do znaczącej, mierzalnej zmiany koloru za pomocą tych odczynników.

Odczynnik biuretowy

Odczynnik biuretowy składa się z wodorotlenku sodu (NaOH) i uwodnionego siarczanu miedzi(II) wraz z winianem sodowo-potasowym , który jest dodawany w celu chelatowania , a tym samym stabilizacji jonów miedzi. Reakcja jonów miedzi z atomami azotu biorącymi udział w wiązaniach peptydowych prowadzi do wyparcia atomów wodoru peptydu w warunkach alkalicznych. Charakterystyczny kolor uzyskuje się w wyniku chelatacji trój- lub czterokleszczowej z azotem peptydowym. Można to znaleźć w przypadku dipeptydów.

Odczynnik jest powszechnie stosowany w oznaczeniu białek biuretowych , kolorymetrycznym teście służącym do oznaczania stężenia białka metodą spektroskopii UV/VIS przy długości fali 540 nm.

Warianty wysokiej czułości testu biuretowego

We współczesnej analizie kolorymetrycznej peptydów powszechnie stosuje się dwie główne modyfikacje testu biuretowego: test kwasu bicynchoniowego (BCA) i test Lowry'ego. W tych testach Cu ⁺ powstały podczas reakcji biuretowej reaguje dalej z innymi odczynnikami, prowadząc do głębszego koloru.

W teście BCA Cu ⁺ tworzy ciemnopurpurowy kompleks z kwasem bicynchoniowym (BCA), który absorbuje około 562 nm, tworząc charakterystyczny fioletoworóżowy kolor. Rozpuszczalny w wodzie kompleks BCA/miedź absorbuje znacznie silniej niż kompleks peptyd/miedź, zwiększając czułość testu biuretowego około 100-krotnie: test BCA pozwala wykryć białka w zakresie od 0,0005 do 2 mg/ml ). Dodatkowo test białka BCA daje ważną korzyść w postaci kompatybilności z substancjami, takimi jak do 5% środków powierzchniowo czynnych w próbkach białka.

W teście białka Lowry'ego Cu ⁺ jest ponownie utleniany do Cu ²⁺ przez Mo ^VI w odczynniku Folina-Ciocalteu , który tworzy błękit molibdenowy (Mo ^IV ). Reszty tyrozyny w białku również tworzą w tych okolicznościach błękit molibdenowy. W ten sposób białka można wykrywać w stężeniach od 0,005 do 2 mg/ml. Z kolei błękit molibdenowy może wiązać niektóre barwniki organiczne, takie jak zieleń malachitowa i auramina O , powodując dalsze wzmocnienie sygnału.

Zewnętrzne linki i notatki

• Złoto. 1990. Związki organiczne w systemach biologicznych, wyd. 2. John Wiley & Sons, Inc.
• Odczynniki chemiczne