Wyświetlacz bakteryjny

Wyświetlacz bakteryjny (lub wyświetlacz bakteryjny lub wyświetlacz bakteryjny ) to technika inżynierii białek stosowana do ewolucji białek in vitro . Biblioteki polipeptydów prezentowane na powierzchni bakterii można przeszukiwać za pomocą cytometrii przepływowej lub iteracyjnych procedur selekcji (biopanning). Ta technika inżynierii białek pozwala nam powiązać funkcję białka z genem, który je koduje. Ekspozycja bakteryjna może być wykorzystana do znalezienia docelowych białek o pożądanych właściwościach i może być wykorzystana do wytworzenia ligandów powinowactwa , które są specyficzne dla komórki. System ten może być używany w wielu zastosowaniach, w tym do tworzenia nowych szczepionek, identyfikacji substratów enzymów i znajdowania powinowactwa ligandu do jego białka docelowego.

Prezentacja bakteryjna jest często połączona z technikami sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) lub sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Konkurencyjne metody ewolucji białek in vitro to prezentacja na fagach , prezentacja na rybosomach , prezentacja na drożdżach i prezentacja na mRNA . Wyświetlacz bakteriofagowy jest najczęściej stosowanym rodzajem systemu wyświetlania, chociaż wyświetlacz bakteryjny staje się coraz bardziej popularny w miarę przezwyciężania wyzwań technicznych. Pokaz bakteryjny w połączeniu z FACS ma również tę zaletę, że jest techniką czasu rzeczywistego.

Historia

Systemy prezentacji komórek zostały po raz pierwszy użyte w 1985 roku, kiedy peptydy zostały genetycznie połączone z białkami prezentowanymi na bakteriofagach M13 . Wyświetlacz bakteriofagowy jest powszechnie stosowanym systemem wyświetlania komórek, chociaż wiąże się z ograniczeniami co do wielkości białek, które można wyświetlić. Następnie w 1986 r. Wprowadzono prezentację bakteryjną, umożliwiając prezentację powierzchniową większych białek. Systemy wyświetlania bakterii zostały po raz pierwszy wprowadzone przez Freudla i in. oraz Charbit i in. w 1986 roku, kiedy użyli bakteryjnych białek powierzchniowych OmpA i LamB do prezentacji peptydów. Freudl i in. fuzje peptydów z linkerami z ompA , powodujące ekspresję peptydów w białkach OmpA. Wykazali , że białka były teraz rozszczepiane przez proteinazę K. Wstawione peptydy inne niż OmpA były zatem celem proteinazy K. Wstawienie obcych peptydów nie wpłynęło na wzrost komórek bakteryjnych. Charbit i in. najpierw zdefiniowali obszary białka LamB, które były „pozwalające” na wstawienie obcego peptydu ( tj. takie , które nie prowadziły do ​​całkowitej utraty funkcjonalności białka). Następnie zbadali wszechstronność miejsc permisywnych (limit wielkości, natura epitopu, ...), które wszystkie były zlokalizowane w odsłoniętych na powierzchni pętlach trimerycznej poriny błony zewnętrznej, mając na celu opracowanie multiwalentnych żywych szczepionek bakteryjnych (12-15 ). Był to pierwszy dowód na wykorzystanie bakteryjnych technik prezentacji powierzchniowej do ekspresji białek na powierzchni komórek bez zmiany funkcji komórki.

Zasada

Peptydy są bardzo przydatne jako substancje terapeutyczne i diagnostyczne. Ich stosowanie staje się coraz bardziej popularne, a systemy wyświetlania oferują użyteczny sposób konstruowania peptydów i optymalizowania ich możliwości wiązania. Komórki wyrażają białka powierzchniowe, które mogą być zaangażowane w cały szereg odpowiedzi, w tym rozpoznawanie innych komórek, interakcje z innymi komórkami i sygnalizację komórkową . Wiele rodzajów bakterii ma białka powierzchniowe komórek, takie jak enteropatogenne intyminy E. coli , które bierze udział w wiązaniu z komórkami gospodarza lub białko OmpA komórek E. coli , które jest ważne w utrzymaniu struktury błony zewnętrznej . Wiele białek powierzchniowych bierze udział w przyczepianiu się komórek bakteryjnych i inwazji na komórkę gospodarza. Za pomocą prezentacji bakteryjnej można zidentyfikować docelowe białka w komórce gospodarza. Te białka powierzchniowe muszą najpierw zostać przeniesione przez błony komórkowe bakterii z cytoplazmy na powierzchnię komórki. Bakterie Gram-ujemne mają dodatkową przestrzeń peryplazmatyczną , której brakuje bakteriom Gram-dodatnim , więc mają trudniejsze zadanie translokacji białek. Prezentacja heterologicznych białek na powierzchni komórki bakteryjnej zwykle wymaga fuzji białka z białkiem powierzchniowym, zwanym rusztowaniem.

Autotransporter System
System autotransportera (system wydzielania typu V)

Szafot

Rusztowania służą do prezentacji heterologicznego białka na powierzchni komórki bakteryjnej. Stosowano różne rusztowania, takie jak białka błony zewnętrznej, białka fimbrii/wici i CPX (kołowo permutowany OmpX). Rusztowanie CPX umożliwia fuzję peptydów na obu końcach rusztowania.

OMP są powszechnymi rusztowaniami do prezentacji bakteryjnej. Białka mogą być również prezentowane na powierzchni komórek bakteryjnych za pomocą autotransporterów. Autotransportery stanowią część systemu wydzielniczego typu V. Zwykle mają trzy domeny: sekwencję liderową na N-końcu; centralna domena pasażerska; domena autotransportera na C-terminalu. Białko heterologiczne jest wstawiane w domenie pasażerskiej. Inną metodą fuzji białek heterologicznych jest fuzja z fimbriami / wiciami , które są nitkowatymi wypustkami na powierzchni komórki. Istnieje wiele fimbrii, głównie na bakteriach Gram-ujemnych, więc wyświetlanie białek na fimbriach jest korzystniejsze niż niektóre inne białka powierzchniowe, których jest mniej. Wadą stosowania fimbrii jest to, że istnieje stosunkowo mały limit rozmiaru wstawki wynoszący 10-30 aminokwasów .

Flow Cytometer Instrument
Cytometr przepływowy

Po fuzji białka heterologicznego z białkiem powierzchniowym komórki bakteryjnej jest ono wystawiane na działanie enzymu , komórki (wyrażającej białko docelowe) lub przeciwciała (zwykle znakowanego fluorescencyjnie ), w zależności od zastosowania eksperymentu. Próbka jest następnie przepuszczana przez wiązkę światła podczas FACS, w bardzo wąskim strumieniu płynu, tak że tylko jedna komórka może przejść jednocześnie, a emitowana fluorescencja jest wykrywana. Informacje o wielkości komórki można uzyskać przez rozproszenie światła, a jeśli nastąpiło związanie białka heterologicznego z docelowym białkiem/komórką, emitowana będzie większa fluorescencja.

Aplikacje

Wyświetlacz powierzchni bakteryjnej może być używany do różnych zastosowań. Obejmują one badania przesiewowe oparte na powinowactwie, mapowanie epitopów przeciwciał , identyfikację substratów peptydowych, identyfikację peptydów wiążących komórki i wytwarzanie szczepionek.

Badanie przesiewowe oparte na powinowactwie

Badania przesiewowe stosuje się w celu znalezienia widocznego powinowactwa białek heterologicznych prezentowanych na powierzchni komórki bakteryjnej do białek docelowych. Ta metoda jest zwykle łączona z FACS, a dodanie niefluorescencyjnego białka docelowego jest korzystne dla uzyskania dokładniejszego powinowactwa wiązania. Dodanie konkurenta zmniejsza prawdopodobieństwo ponownego wiązania białek docelowych, co spowodowałoby, że powinowactwo wiązania byłoby mniej dokładne.

Cykliczne peptydy wiążące Badania przesiewowe

Cykliczne peptydy mogą być z powodzeniem prezentowane na powierzchni komórki bakteryjnej. Dzięki randomizacji DNA miliony cyklicznych peptydów prezentowanych na powierzchni komórki można przeszukiwać pod kątem celu białkowego przy użyciu wysokoprzepustowego FACS.

Mapowanie epitopów przeciwciał

Mapowanie epitopu przeciwciała służy do znalezienia specyficzności przeciwciała. Epitop ekspresję regionu genu kodującego antygen. Cytometrię przepływową z przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie stosuje się do wykrywania ilości przeciwciał wiążących się z epitopem.

Identyfikacja substratów peptydowych

Można to zastosować do znalezienia najlepszych substratów dla enzymów proteolitycznych . Substrat jest prezentowany na powierzchni komórki bakteryjnej między ligandem powinowactwa a rusztowaniem, a kinetykę proteolizy substratu mierzy się za pomocą FACS.

Identyfikacja peptydów wiążących komórki

Ekspozycję bakteryjną można wykorzystać do znalezienia peptydów, które wiążą się z określonymi komórkami, np. komórkami raka piersi lub komórkami macierzystymi . Wyświetlane białka są znakowane fluorescencyjnie GFP , więc interakcje wiązania między peptydami a komórkami docelowymi można zobaczyć za pomocą cytometrii przepływowej. Próbki kontrolne są wymagane do pomiaru poziomów fluorescencji przy braku prezentowanych peptydów. Wymagane są również próbki, które nie zawierają eksponowanych peptydów, ale zawierają komórki ssaków i komórki bakteryjne (w tym rusztowanie).

Dostawa szczepionek

szczepionek jest bardzo powszechnym zastosowaniem prezentacji powierzchni bakteryjnej. Istnieją dwa rodzaje żywych szczepionek bakteryjnych, które można wytworzyć:

  1. Zwykle chorobotwórcze bakterie są osłabione, więc nie są już chorobotwórcze.
  2. komensalne lub spożywcze, które nie są chorobotwórcze.

Wykorzystanie bakteryjnej prezentacji antygenów na powierzchni jest cenną alternatywą dla konwencjonalnego projektowania szczepionek z różnych powodów, a jednym z nich jest to, że białka eksprymowane na powierzchni komórki bakteryjnej mogą działać korzystnie jako adiuwant . Konwencjonalne szczepionki wymagają dodatku adiuwantów. Inną zaletą generowania szczepionek przy użyciu systemów prezentacji bakteryjnej jest to, że cała komórka bakteryjna może zostać włączona do żywej szczepionki W przeciwieństwie do systemów prezentacji bakteriofagowej, które są zwykle stosowane w opracowywaniu szczepionek w celu znalezienia nieznanych epitopów, systemy prezentacji bakteryjnej są wykorzystywane do ekspresji znanych epitopów i komórek działać jako system dostarczania szczepionki.


Porównanie z prezentacją na fagach

W podobnych warunkach selekcja peptydów eksponowanych w bakteriach do modelowania białka streptawidyny okazała się gorsza.

  1. ^    Kenrick SA, Daugherty PS (2010). „Wyświetlacz bakteryjny umożliwia wydajne i ilościowe dojrzewanie powinowactwa peptydów” . Białko Eng Des Sel . 23 (1): 9–17. doi : 10.1093/białko/gzp065 . PMC 2791049 . PMID 19903738 .
  2. ^   Freudl R, MacIntyre S, Degen M, Henning U (1986). „Ekspozycja powierzchni komórki białka błony zewnętrznej OmpA Escherichia coli K-12”. J Mol Biol . 188 (3): 491–4. doi : 10.1016/0022-2836(86)90171-3 . PMID 3525847 .
  3. ^   Wang Y. (2002). „Funkcja OmpA w Escherichia coli”. Biochem Biophys Res Commun . 292 (2): 396–401. doi : 10.1006/bbrc.2002.6657 . PMID 11906175 .
  4. ^    Getz JA, Schoep TD, Daugherty PS (2012). „Odkrywanie peptydów przy użyciu wyświetlacza bakteryjnego i cytometrii przepływowej”. Inżynieria białek dla celów terapeutycznych, część B. Metody Enzymol . Metody w enzymologii. Tom. 503. s. 75–97. doi : 10.1016/B978-0-12-396962-0.00004-5 . ISBN 9780123969620 . PMID 22230566 .
  5. ^    Wernerus H, Stahl S (2004). „Aplikacje biotechnologiczne dla bakterii inżynierii powierzchniowej”. Biotechnologia Appl Biochem . 40 (część 3): 209–28. doi : 10.1042/BA20040014 . PMID 15035661 . S2CID 9395029 .
  6. ^   Klemm P, Schembri MA (2000). „Adhezyny bakteryjne: funkcja i struktura”. Int J Med Microbiol . 290 (1): 27–35. doi : 10.1016/S1438-4221(00)80102-2 . PMID 11043979 .
  7. Bibliografia   _ „Inżynieria białkowa z wyświetlaczem bakteryjnym”. Curr Opin Struct Biol . 17 (4): 474–80. doi : 10.1016/j.sbi.2007.07.004 . PMID 17728126 .
  8. Bibliografia     _ Becher, Kira S.; Nienberg, chrześcijanin; Józef, Joachim; Mootz, Henning D. (2019-01-02). „Wyświetlanie na powierzchni komórek bakteryjnych półsyntetycznych cyklicznych peptydów” . ChemBioChem . 20 (1): 72–77. doi : 10.1002/cbic.201800552 . ISSN 1439-4227 . PMID 30216604 . S2CID 52277462 .
  9. Bibliografia     _ Józef, Joachim; Mootz, Henning D. (2022), Coppock, Matthew B.; Winton, Alexander J. (red.), „Preparation of Bacterial Cell-Surface Displayed Semisynthetic” , Peptide Macrocycles , Nowy Jork, NY: Springer US, tom. 2371, s. 193–213, doi : 10.1007/978-1-0716-1689-5_11 , ISBN 978-1-0716-1688-8 , PMID 34596850 , S2CID 238237296 , pobrane 2022-05-12
  10. ^    Rockberg J, Lofblom J, Hjelm B, Uhlen M, Stahl S (2008). „Mapowanie epitopów przeciwciał za pomocą wyświetlania powierzchni bakteryjnej”. Metody natury . 5 (12): 1039–45. doi : 10.1038/nmeth.1272 . PMID 19029907 . S2CID 12078882 .
  11. ^   Westerlund-Wikstrom B (2000). „Wyświetlacz peptydowy na wici bakteryjnej: zasady i zastosowania”. Int J Med Microbiol . 290 (3): 223–30. doi : 10.1016/S1438-4221(00)80119-8 . PMID 10959724 .
  12. ^   Benhar I (2001). „Biotechnologiczne zastosowania prezentacji na fagach i komórkach”. Postępy biotechnologii . 19 (1): 1–33. doi : 10.1016/S0734-9750(00)00054-9 . PMID 14538090 .
  13. Bibliografia    _ (2005). „Porównanie bibliotek peptydów bakteryjnych i fagowych w poszukiwaniu motywu wiązania celu”. Biochemia stosowana i biotechnologia . 127 (2): 125–131. doi : 10.1385/ABAB:127:2:125 . PMID 16258189 . S2CID 45243314 .

12. Charbit A, Boulain JC, Ryter A, Hofnung M. Sondowanie topologii białka błony bakteryjnej przez genetyczną insercję obcego epitopu; ekspresja na powierzchni komórki. EMBO J. 1986 listopad;5(11):3029-37.

13. Charbit A, Sobczak E, Michel ML, Molla A, Tiollais P, Hofnung M. Prezentacja dwóch epitopów regionu preS2 wirusa zapalenia wątroby typu B na żywych rekombinowanych bakteriach. J Immunol. 1 września 1987;139(5):1658-64.

14. Charbit A, Molla A, Saurin W, Hofnung M. Wszechstronność wektora do ekspresji obcych polipeptydów na powierzchni bakterii Gram-ujemnych. Gen. 15 października 1988;70(1):181-9.

15. Newton SM, Klebba PE, Michel V, Hofnung M, Charbit A. Topologia białka błonowego LamB przez znakowanie epitopami i porównanie z modelem rentgenowskim. Bakteriol J. Czerwiec 1996;178(12):3447-56.

Pobrano z „ https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Bacterial_display&oldid=1138800474 ”