Test białek Bradforda

Ten artykuł dotyczy procedury naukowej. W przypadku innych zastosowań zobacz Bradford (ujednoznacznienie) .

Test białek Bradforda został opracowany przez Marion M. Bradford w 1976 roku. Jest to szybka i dokładna spektroskopowa procedura analityczna stosowana do pomiaru stężenia białka w roztworze. Reakcja zależy od składu aminokwasowego mierzonych białek.

Zasada

Ryc. 1. Błękit brylantowy Coomassie G-250, barwnik wiążący w metodzie Bradforda
Reakcja barwna białka i odczynnik Bradforda

Test Bradforda, kolorymetryczny test białka , opiera się na przesunięciu absorbancji barwnika Coomassie brylantowy błękit G-250 . Błękit brylantowy Coomassie G-250 występuje w trzech formach: anionowej (niebieski), neutralnej (zielony) i kationowej (czerwony). W warunkach kwaśnych czerwona postać barwnika przekształca się w niebieską, wiążąc się z badanym białkiem. Jeśli nie ma białka do związania, roztwór pozostanie brązowy. Barwnik tworzy silny, niekowalencyjny kompleks z grupą karboksylową białka siłą van der Waalsa i grupą aminową poprzez oddziaływania elektrostatyczne. Podczas tworzenia tego kompleksu czerwona postać barwnika Coomassie najpierw przekazuje swój wolny elektron jonizowalnym grupom na białku, co powoduje zakłócenie stanu natywnego białka, w konsekwencji odsłaniając jego hydrofobowe kieszenie . Te kieszenie w trzeciorzędowej strukturze białka wiążą się niekowalencyjnie z niepolarnym regionem barwnika poprzez oddziaływanie pierwszego wiązania ( siły van der Waalsa ), które umieszczają dodatnie grupy aminowe w pobliżu ujemnego ładunku barwnika. Wiązanie jest dodatkowo wzmacniane przez drugie oddziaływanie wiązania między nimi, oddziaływanie jonowe. Kiedy barwnik wiąże się z białkiem, powoduje przesunięcie z 465 nm do 595 nm, dlatego odczyty absorbancji są wykonywane przy 595 nm.

Postać kationowa (niezwiązana) jest zielono-czerwona i ma maksimum widma absorpcji , które historycznie uważano za 465 nm . Anionowa związana postać barwnika, która jest utrzymywana razem przez oddziaływania hydrofobowe i jonowe, ma maksimum widma absorpcji, które historycznie utrzymywano przy 595 nm . Wzrost absorbancji przy 595 nm jest proporcjonalny do ilości związanego barwnika, a tym samym do ilości (stężenia) białka obecnego w próbce.

W przeciwieństwie do innych testów białkowych, test białkowy Bradforda jest mniej podatny na zakłócenia ze strony różnych związków chemicznych, takich jak sód, potas, a nawet węglowodany, takie jak sacharoza, które mogą być obecne w próbkach białek. Wyjątkiem jest podwyższone stężenie detergentu . Dodecylosiarczan sodu (SDS), powszechny detergent, można znaleźć w ekstraktach białkowych, ponieważ jest używany do lizy komórek poprzez rozerwanie dwuwarstwy lipidowej błony i do denaturacji białek dla SDS-PAGE . Podczas gdy inne detergenty zakłócają test w wysokich stężeniach, zakłócenia powodowane przez SDS mają dwa różne tryby, a każdy z nich występuje w innym stężeniu. Gdy stężenia SDS są poniżej krytycznego stężenia miceli (znanego jako CMC, 0,00333% wag./obj. do 0,0667%) w roztworze barwnika Coomassie, detergent ma tendencję do silnego wiązania się z białkiem, hamując miejsca wiązania białka dla odczynnika barwiącego. Może to spowodować niedoszacowanie stężenia białka w roztworze. Kiedy stężenia SDS są powyżej CMC, detergent silnie łączy się z zieloną postacią barwnika Coomassie, powodując przesunięcie równowagi, wytwarzając w ten sposób więcej niebieskiej postaci. Powoduje to wzrost absorbancji przy 595 nm niezależnie od obecności białka.

Inne zakłócenia mogą pochodzić z buforu używanego podczas przygotowywania próbki białka. Wysokie stężenie buforu spowoduje przeszacowanie stężenia białka z powodu wyczerpania wolnych protonów z roztworu przez skoniugowaną zasadę z buforu. Nie będzie to problemem, jeśli zastosuje się niskie stężenie białka (później bufor).

Aby zmierzyć absorbancję bezbarwnego związku, należy wykonać test Bradforda. Niektóre bezbarwne związki, takie jak białka, można oznaczyć ilościowo przy gęstości optycznej 280 nm ze względu na obecność pierścieni aromatycznych, takich jak tryptofan, tyrozyna i fenyloalanina, ale jeśli żaden z tych aminokwasów nie jest obecny, wówczas absorpcji nie można zmierzyć przy 280 nm.

Zalety

Wiele roztworów zawierających białka ma najwyższą absorpcję przy 280 nm w spektrofotometrze, w zakresie UV. Wymaga to spektrofotometrów zdolnych do pomiaru w zakresie UV, czego wielu nie potrafi. Dodatkowo maksima absorpcji przy 280 nm wymagają, aby białka zawierały aminokwasy aromatyczne, takie jak tyrozyna (Y), fenyloalanina (F) i/lub tryptofan (W). Nie wszystkie białka zawierają te aminokwasy, co może zafałszować pomiary stężenia. Jeśli w próbce obecne są kwasy nukleinowe, absorbują one również światło o długości fali 280 nm, jeszcze bardziej wypaczając wyniki. Stosując test białek Bradforda, można uniknąć wszystkich tych komplikacji, po prostu mieszając próbki białek z barwnikiem G-250 z błękitem brylantowym Coomassie (odczynnik Bradforda) i mierząc ich absorbancje przy długości fali 595 nm, która znajduje się w zakresie widzialnym i może być dokładnie mierzone za pomocą mobilnego aparatu w smartfonie.

Procedura oznaczania białka Bradforda jest bardzo łatwa i prosta do wykonania. Odbywa się to w jednym etapie, w którym odczynnik Bradforda jest dodawany do probówki wraz z próbką. Po dokładnym wymieszaniu mieszanina niemal natychmiast zmienia kolor na niebieski. Kiedy barwnik wiąże się z białkami w procesie trwającym około 2 minut, następuje zmiana maksimum absorpcji barwnika z 465 nm na 595 nm w roztworach kwaśnych. Barwnik ten tworzy silne niekowalencyjne wiązania z białkami poprzez oddziaływania elektrostatyczne z grupami aminowymi i karboksylowymi, a także oddziaływania Van Der Waalsa. Tylko cząsteczki, które wiążą się z białkami w roztworze, wykazują tę zmianę absorpcji, co eliminuje obawy, że niezwiązane cząsteczki barwnika mogą przyczynić się do eksperymentalnie uzyskanego odczytu absorpcji. Ten proces jest korzystniejszy, ponieważ jest tańszy niż inne metody, łatwy w użyciu i ma wysoką czułość barwnika na białko.

Po 5 minutach inkubacji można odczytać absorbancję przy długości fali 595 nm za pomocą spektrofotometru lub aparatu mobilnego w smartfonie (metoda RGBradford).

Ten test jest jednym z najszybszych testów przeprowadzanych na białkach. Całkowity czas potrzebny na skonfigurowanie i ukończenie testu wynosi mniej niż 30 minut. Cały eksperyment przeprowadza się w temperaturze pokojowej.

Test białek Bradforda może mierzyć ilości białka zaledwie od 1 do 20 μg. Jest to niezwykle czuła technika.

Odczynnik barwiący jest stabilnym, gotowym do użycia produktem przygotowanym w kwasie fosforowym . Może pozostawać w temperaturze pokojowej do 2 tygodni, zanim zacznie się rozkładać.

Próbki białek zwykle zawierają sole, rozpuszczalniki, bufory, konserwanty, środki redukujące i czynniki chelatujące metale. Cząsteczki te są często używane do rozpuszczania i stabilizowania białek. Inne testy białek, takie jak BCA i Lowry, są nieskuteczne, ponieważ cząsteczki, takie jak czynniki redukujące, zakłócają test. Korzystanie z Bradforda może być korzystne w stosunku do tych cząsteczek, ponieważ są one kompatybilne ze sobą i nie będą kolidować.

Wykres liniowy uzyskany z testu (absorbancja w funkcji stężenia białka w μg/ml) można łatwo ekstrapolować w celu określenia stężenia białek za pomocą nachylenia linii.

Jest to czuła technika. Jest to również bardzo proste: pomiar OD przy 595 nm po 5 minutach inkubacji. W metodzie tej można również wykorzystać spektrofotometr Vis lub aparat w smartfonie mobilnym (metoda RGBradford).

Niedogodności

Test Bradforda jest liniowy w krótkim zakresie, zwykle od 0 µg/mL do 2000 µg/mL, co często wymaga rozcieńczenia próbki przed analizą. Podczas sporządzania tych rozcieńczeń błąd w jednym rozcieńczeniu jest nakładany na kolejne rozcieńczenia, co skutkuje liniową zależnością, która nie zawsze może być dokładna.

Podstawowe warunki i detergenty, takie jak SDS, mogą zakłócać zdolność barwnika do wiązania się z białkiem poprzez jego łańcuchy boczne. Jednakże, istnieją pewne białka odstraszające, możliwe jest, że zmierzone stężenie będzie niedokładne. [ wymagane wyjaśnienie ]

Odczynniki stosowane w tej metodzie mają tendencję do zabarwiania probówek. Nie można używać tych samych probówek, ponieważ plama wpłynęłaby na odczyt absorbancji. Ta metoda jest również wrażliwa na czas. W przypadku testowania więcej niż jednego roztworu ważne jest, aby każda próbka była inkubowana przez taki sam czas w celu dokładnego porównania.

Hamuje go również obecność detergentów, chociaż problem ten można złagodzić przez dodanie cyklodekstryn do mieszaniny testowej.

Duża część nieliniowości wynika z równowagi między dwiema różnymi formami barwnika, która jest zaburzona przez dodanie białka. Test Bradforda linearyzuje przez pomiar stosunku absorbancji, 595 przy 450 nm. Ten zmodyfikowany test Bradforda jest około 10 razy bardziej czuły niż konwencjonalny.

Barwnik Coomassie Blue G250 stosowany do wiązania białek w oryginalnej metodzie Bradforda łatwo wiąże się z grupami argininy i lizyny białek. Jest to wadą, ponieważ preferencja barwnika do wiązania się z tymi aminokwasami może skutkować zróżnicowaną odpowiedzią testu między różnymi białkami. Zmiany w oryginalnej metodzie, takie jak zwiększenie pH przez dodanie NaOH lub dodanie większej ilości barwnika, zostały wprowadzone w celu skorygowania tej zmiany. Chociaż modyfikacje te skutkują mniejszą czułością testu, zmodyfikowana metoda staje się wrażliwa na detergenty, które mogą wpływać na próbkę.

Przykładowa procedura Bradforda

Materiały

  • Liofilizowana gamma globulina z osocza bydlęcego
  • Błękit brylantowy Coomassie 1
  • 0,15 M NaCl
  • Spektrofotometr i kuwety lub mobilna kamera w smartfonie (metoda RGBradford).
  • Mikropipety

Procedura (test standardowy, 20-150 µg białka; 200-1500 µg/ml)

  1. Przygotuj serię wzorców rozcieńczonych 0,15 M NaCl do końcowych stężeń 0 (ślepa próba = brak białka), 250, 500, 750 i 1500 µg/mL. Przygotuj również seryjne rozcieńczenia nieznanej próbki do pomiaru.
  2. Dodaj 100 µl każdego z powyższych do osobnej probówki (lub probówki spektrofotometru, jeśli używasz Spectronic 20 ).
  3. Dodać 5,0 ml Coomassie Blue do każdej probówki i wymieszać przez worteksowanie lub odwracanie.
  4. Ustawić spektrofotometr na długość fali 595 nm, używając probówki niezawierającej białka (pustej).
  5. Odczekać 5 minut i odczytać każdy ze standardów i każdą z próbek przy długości fali 595 nm.
  6. Sporządzić wykres absorbancji wzorców w funkcji ich stężenia. Oblicz współczynnik ekstynkcji i oblicz stężenia nieznanych próbek.

Procedura (mikrotest, 1-10 µg białka/ml)

  1. Przygotuj standardowe stężenia białka 1, 5, 7,5 i 10 µg/ml. Przygotuj ślepą próbę tylko z NaCl. Przygotować serię rozcieńczeń próbek.
  2. Dodać 100 µl każdego z powyższych składników do oddzielnych probówek (użyć probówek do mikrowirówki) i dodać 1,0 mL Coomassie Blue do każdej probówki.
  3. Włączyć i ustawić spektrofotometr na długość fali 595 nm i wyzerować spektrofotometr za pomocą kuwet 1,5 mL lub użyć mobilnego aparatu w smartfonie (metoda RGBradford).
  4. Odczekać 2 minuty i odczytać absorbancję każdego standardu i próbki przy 595 nm.
  5. Sporządzić wykres absorbancji wzorców w funkcji ich stężenia. Oblicz współczynnik ekstynkcji i oblicz stężenia nieznanych próbek.

Wykorzystanie uzyskanych danych do znalezienia stężenia nieznanego

Podsumowując, aby znaleźć krzywą standardową, należy użyć różnych stężeń BSA ( albuminy surowicy bydlęcej ) w celu stworzenia krzywej standardowej ze stężeniem wykreślonym na osi x i absorbancją na osi y. Stosowane jest tylko wąskie stężenie BSA (2-10 ug/ml) w celu stworzenia dokładnej krzywej wzorcowej. Zastosowanie szerokiego zakresu stężeń białek utrudni określenie stężenia nieznanego białka. Ta standardowa krzywa jest następnie używana do określenia stężenia nieznanego białka. Poniżej omówiono, w jaki sposób przechodzi się od krzywej standardowej do stężenia nieznanego.

Najpierw dodaj linię najlepszego dopasowania lub regresję liniową i wyświetl równanie na wykresie. W idealnym przypadku wartość R2 będzie możliwie najbliższa 1. R reprezentuje sumę kwadratów wartości dopasowania odjętych od każdego punktu danych. Dlatego jeśli R2 jest znacznie mniejsze niż jeden, rozważ powtórzenie eksperymentu, aby uzyskać bardziej wiarygodne dane.

Wykres 1. Rzeczywiste dane BSA uzyskane ze spektrofotometru UV-Vis w skali mikro

Równanie przedstawione na wykresie umożliwia obliczenie absorbancji, a tym samym stężenia nieznanych próbek. Na wykresie 1 x to stężenie, a y to absorbancja, więc należy zmienić równanie, aby rozwiązać x i wprowadzić absorbancję zmierzonej niewiadomej. Jest prawdopodobne, że niewiadoma będzie miała wartości absorbancji poza zakresem normy. Nie należy ich uwzględniać w obliczeniach, ponieważ podane równanie nie może odnosić się do liczb poza jego ograniczeniami. W dużej skali należy obliczyć współczynnik ekstynkcji, korzystając z prawa Lamberta-Beera A=εLC, w którym A to zmierzona absorbancja, ε to nachylenie krzywej wzorcowej, L to długość kuwety, a C to stężenie być zdeterminowanym. W skali mikro nie można użyć kuwety i dlatego wystarczy przestawić, aby obliczyć x.

Tabela 1. Rzeczywiste dane testowe dla określenia stężenia nieznanego związku w oparciu o linię najlepszego dopasowania powyższej krzywej wzorcowej

Aby uzyskać stężenie, które ma sens z danymi, należy znormalizować rozcieńczenia, stężenia i jednostki nieznane (Tabela 1). Aby to zrobić, należy podzielić stężenie przez objętość białka w celu znormalizowania stężenia i pomnożyć przez ilość rozcieńczonego białka, aby skorygować wszelkie rozcieńczenia wykonane w białku przed wykonaniem testu.

Testy alternatywne

Alternatywne testy białek obejmują:

Dalsza lektura

Linki zewnętrzne

Pobrano z „ https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Bradford_protein_assay&oldid=1140077175 ”