Znakowanie immunologiczne

Znakowanie immunologiczne — wykrywanie antygenu w tkance za pomocą znakowanego przeciwciała swoistego dla antygenu

Znakowanie immunologiczne to proces biochemiczny, który umożliwia wykrycie i zlokalizowanie antygenu w określonym miejscu w komórce, tkance lub narządzie. Antygeny to cząsteczki organiczne, zwykle białka , zdolne do wiązania się z przeciwciałem . Antygeny te można wizualizować za pomocą kombinacji przeciwciał specyficznych dla antygenu, jak również sposobu wykrywania, zwanego znacznikiem, który jest kowalencyjnie połączony z przeciwciałem. Jeśli proces znakowania immunologicznego ma na celu ujawnienie informacji o komórce lub jej podstrukturach, proces ten nazywa się immunocytochemią . Immunoznakowanie większych struktur nazywa się immunohistochemią .

Wytwarzanie przeciwciał do znakowania immunologicznego obejmuje dwa złożone etapy. Pierwszym jest wytwarzanie przeciwciała, które wiąże się specyficznie z antygenem będącym przedmiotem zainteresowania, a drugim jest fuzja znacznika z przeciwciałem. Ponieważ fuzja znacznika z każdym możliwym przeciwciałem specyficznym dla antygenu jest niepraktyczna, większość procesów znakowania immunologicznego wykorzystuje pośrednią metodę wykrywania. Ta metoda pośrednia wykorzystuje pierwszorzędowe przeciwciało , które jest swoiste dla antygenu i drugorzędowe przeciwciało połączone ze znacznikiem, który specyficznie wiąże pierwszorzędowe przeciwciało. To podejście pośrednie umożliwia masową produkcję przeciwciał drugorzędowych, które można kupić z półki. Zgodnie z tą metodą pośrednią do układu testowego dodaje się przeciwciało pierwszorzędowe. Pierwotne przeciwciało wyszukuje i wiąże się z docelowym antygenem. Następnie dodaje się znakowane przeciwciało drugorzędowe, przeznaczone do przyłączania się wyłącznie do przeciwciała pierwszorzędowego.

Typowe znaczniki obejmują: związek fluorescencyjny , złote kulki, określony znacznik epitopowy lub enzym wytwarzający barwny związek. Połączenie znaczników z celem poprzez przeciwciała zapewnia identyfikację i wizualizację antygenu będącego przedmiotem zainteresowania w jego natywnym miejscu w tkance, takim jak błona komórkowa , cytoplazma lub błona jądrowa . W pewnych warunkach metodę można dostosować w celu dostarczenia informacji ilościowych.

Znakowanie immunologiczne może być stosowane w farmakologii , biologii molekularnej , biochemii i każdej innej dziedzinie, w której ważna jest wiedza o dokładnej lokalizacji cząsteczki wiążącej przeciwciało.

Metoda pośrednia a metoda bezpośrednia

Istnieją dwie metody znakowania immunologicznego, metody bezpośrednie i pośrednie. W bezpośredniej metodzie immunoznakowania przeciwciało pierwszorzędowe jest sprzęgane bezpośrednio ze znacznikiem. Metoda bezpośrednia jest użyteczna w minimalizowaniu reakcji krzyżowej , miary nieswoistości, która jest nieodłączna dla wszystkich przeciwciał i która jest mnożona przez każde dodatkowe przeciwciało użyte do wykrycia antygenu. Jednak metoda bezpośrednia jest znacznie mniej praktyczna niż metoda pośrednia i nie jest powszechnie stosowana w laboratoriach, ponieważ przeciwciała pierwotne muszą być znakowane kowalencyjnie, co wymaga dużej ilości oczyszczonego przeciwciała. Ponadto metoda bezpośrednia jest potencjalnie znacznie mniej czuła niż metoda pośrednia. Ponieważ kilka przeciwciał drugorzędowych jest zdolnych do wiązania się z różnymi częściami lub domenami pojedynczego przeciwciała pierwszorzędowego wiążącego docelowy antygen, z każdym antygenem związanych jest więcej znakowanych przeciwciał. Więcej znaczników na antygen skutkuje większym sygnałem na antygen.

W celu uzyskania wysokiego stopnia specyficzności i czułości można zastosować różne metody pośrednie. Po pierwsze, często stosuje się protokoły dwuetapowe, aby uniknąć reakcji krzyżowej między znakowaniem immunologicznym wielu przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych , gdzie często stosuje się drugorzędowe przeciwciała wiążące antygen . Po drugie, można zastosować haptenylowane przeciwciała pierwszorzędowe, przy czym przeciwciało drugorzędowe może rozpoznawać powiązany hapten . Hapten jest kowalencyjnie połączony z przeciwciałem pierwszorzędowym przez sukcynylu lub skoniugowaną IgG Fc -specyficzną świetne sekcje. Wreszcie, pierwszorzędowe przeciwciała monoklonalne , które mają różne izotypy Ig, można wykryć za pomocą specyficznych przeciwciał drugorzędowych, które są skierowane przeciwko izotypowi będącemu przedmiotem zainteresowania.

Wiązanie i specyficzność przeciwciał

Ogólnie rzecz biorąc, przeciwciała muszą wiązać się z antygenami z wysoką specyficznością i powinowactwem. Specyficzność wiązania odnosi się do zdolności przeciwciała do wiązania i wiązania tylko jednego docelowego antygenu. Naukowcy powszechnie stosują przeciwciała monoklonalne i przeciwciała poliklonalne , które składają się z syntetycznych peptydów. Podczas wytwarzania tych przeciwciał przeciwciała specyficzne dla antygenu są sekwestrowane przez przyłączenie peptydu antygenowego do kolumny powinowactwa i umożliwienie nieswoistemu przeciwciału po prostu przejścia przez kolumnę. Zmniejsza to prawdopodobieństwo, że przeciwciała zwiążą się z niepożądanym epitopem antygenu, którego nie ma na początkowym peptydzie. W związku z tym specyficzność przeciwciała jest ustalana przez specyficzną reakcję z białkiem lub peptydem stosowanym do immunizacji specyficznymi metodami, takimi jak immunoblotting lub immunoprecypitacja .

Przy ustalaniu specyficzności przeciwciał kluczowym czynnikiem jest rodzaj stosowanych syntetycznych peptydów lub oczyszczonych białek. Im mniejsza specyficzność przeciwciała, tym większa szansa na wizualizację czegoś innego niż docelowy antygen. W przypadku peptydów syntetycznych zaletą jest to, że aminokwasowa jest łatwo dostępna, ale peptydy nie zawsze przypominają trójwymiarową strukturę lub modyfikację potranslacyjną występuje w natywnej postaci białka. Dlatego przeciwciała, które są wytwarzane do działania przeciwko syntetycznemu peptydowi, mogą mieć problemy z natywnym białkiem 3D. Te typy przeciwciał prowadziłyby do słabych wyników w eksperymentach z immunoprecypitacją lub immunohistochemią , jednak przeciwciała mogą być zdolne do wiązania się ze zdenaturowaną postacią białka podczas testu immunoblottingu. Przeciwnie, jeśli przeciwciało działa dobrze na oczyszczone białka w ich natywnej postaci, a nie zdenaturowane , immunoblot nie może być stosowany jako standaryzowany test do określenia specyficzności wiązania przeciwciała, szczególnie w immunohistochemii.

Specyficzne techniki znakowania immunologicznego

Znakowanie immunologiczne do mikroskopii świetlnej

Mikroskopia świetlna to użycie mikroskopu świetlnego , który jest instrumentem wymagającym użycia światła do oglądania powiększonej próbki. Ogólnie rzecz biorąc, często używany jest złożony mikroskop świetlny, w którym dwie soczewki, okular i obiektyw działają jednocześnie, aby wygenerować powiększenie preparatu. Mikroskopia świetlna często wykorzystuje znakowanie immunologiczne do obserwacji docelowych tkanek lub komórek. Na przykład przeprowadzono badanie, aby przyjrzeć się morfologii i produkcji hormonów w hodowlach komórek gruczolaka przysadki za pomocą mikroskopii świetlnej i innych metod mikroskopii elektronowej. Ten rodzaj mikroskopii potwierdził, że pierwotne hodowle komórek gruczolaka zachowują swoje właściwości fizjologiczne in vitro , co odpowiadało kontroli histologicznej. Ponadto hodowle komórkowe ludzkich gruczolaków przysadki oglądano za pomocą mikroskopii świetlnej i immunocytochemii, gdzie komórki te utrwalano i znakowano immunologicznie mysim przeciwciałem monoklonalnym przeciwko ludzkiemu GH i poliklonalnym przeciwciałem króliczym przeciwko PRL. Jest to przykład tego, jak wyznakowana immunologicznie hodowla komórek gruczolaka przysadki, które były oglądane za pomocą mikroskopii świetlnej i innych technik mikroskopii elektronowej, może pomóc we właściwej diagnozie guzów.

Znakowanie immunologiczne w mikroskopii elektronowej

Mikroskopia elektronowa (EM) to skoncentrowana dziedzina nauki, która wykorzystuje mikroskop elektronowy jako narzędzie do oglądania tkanek. Mikroskopia elektronowa ma poziom powiększenia do 2 milionów razy, podczas gdy mikroskopia świetlna ma powiększenie tylko do 1000-2000 razy. Istnieją dwa rodzaje mikroskopów elektronowych, transmisyjny mikroskop elektronowy i skaningowy mikroskop elektronowy .

Mikroskopia elektronowa jest powszechną metodą wykorzystującą technikę znakowania immunologicznego do oglądania oznakowanych tkanek lub komórek. Metoda mikroskopu elektronowego opiera się na wielu takich samych koncepcjach, jak znakowanie immunologiczne w mikroskopii świetlnej, w której określone przeciwciało jest w stanie rozpoznać położenie antygenu będącego przedmiotem zainteresowania, a następnie obejrzeć je pod mikroskopem elektronowym. Przewagą mikroskopii elektronowej nad mikroskopią świetlną jest możliwość oglądania docelowych obszarów na poziomie subkomórkowym. Ogólnie rzecz biorąc, metal ciężki o dużej gęstości elektronowej jest używany do EM, który może odbijać padające elektrony. Znakowanie immunologiczne jest zwykle potwierdzane za pomocą mikroskopu świetlnego w celu zapewnienia obecności antygenu, a następnie sprawdzane pod mikroskopem elektronowym.

chromosomów często stosuje się znakowanie immunologiczne i mikroskopię elektronową . Przeprowadzono badanie, aby zobaczyć możliwe ulepszenia struktur chromosomów do znakowania immunologicznego, takich jak topoizomeraza IIα i kondensacja w wypreparowanych chromosomach mitotycznych . W szczególności badacze ci wykorzystali napromienianie UV oddzielonych jąder lub wykazali, w jaki sposób chromosomy wspomagają wysokie poziomy swoistego znakowania immunologicznego, które obserwowano za pomocą mikroskopii elektronowej.

Znakowanie immunologiczne w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) wykorzystuje transmisyjny mikroskop elektronowy do tworzenia dwuwymiarowego obrazu poprzez wystrzeliwanie elektronów przez cienki kawałek tkanki. Im jaśniejsze są pewne obszary na obrazie, tym więcej elektronów może przejść przez próbkę. Transmisyjna mikroskopia elektronowa została wykorzystana jako sposób oglądania immunoznakowanych tkanek i komórek. Na przykład bakterie można oglądać za pomocą TEM po zastosowaniu znakowania immunologicznego. Przeprowadzono badanie w celu zbadania struktur fimbrii CS3 i CS6 w różnych Escherichia coli szczepy, które wykryto za pomocą TEM, a następnie barwienia ujemnego i znakowania immunologicznego. Dokładniej, znakowanie immunologiczne fimbrii potwierdziło istnienie różnych antygenów powierzchniowych.

Znakowanie immunologiczne do skaningowej mikroskopii elektronowej

Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) wykorzystuje skaningowy mikroskop elektronowy, który wytwarza duże obrazy postrzegane jako trójwymiarowe, podczas gdy w rzeczywistości takie nie są. Ten typ mikroskopu koncentruje wiązkę elektronów na bardzo małej powierzchni (2-3 nm) próbki w celu wytworzenia elektronów z tej próbki. Te elektrony wtórne są wykrywane przez czujnik, a obraz próbki jest generowany przez określony czas.

Skaningowa mikroskopia elektronowa jest często stosowaną techniką znakowania immunologicznego. SEM jest w stanie wykryć powierzchnię składników komórkowych w wysokiej rozdzielczości. Ta technika znakowania immunologicznego jest bardzo podobna do metody immunofluorescencyjnej, ale zamiast fluoroforu stosuje się znacznik ze złota koloidalnego. Ogólnie rzecz biorąc, koncepcje są bardzo równoległe, ponieważ stosuje się nieskoniugowane przeciwciało pierwszorzędowe, a następnie znakowane przeciwciało drugorzędowe, które działa przeciwko przeciwciału pierwszorzędowemu. Czasami SEM w połączeniu ze znakowaniem immunologicznym cząstek złota jest kłopotliwe w odniesieniu do rozdzielczości cząstek i ładunków pod wiązką elektronów; jednak ten spadek rozdzielczości został rozwiązany dzięki ulepszeniu oprzyrządowania SEM poprzez obrazowanie elektronów wstecznie rozproszonych. Dzieje się tak, ponieważ wzory dyfrakcji wstecznie rozproszonych elektronów zapewniają czystą powierzchnię próbki do interakcji z pierwotną wiązką elektronów.

Znakowanie immunologiczne złotem (Immunogold Labelling)

Znakowanie immunologiczne cząstkami złota, znane również jako barwienie immunogoldem , jest regularnie stosowane w skaningowej mikroskopii elektronowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej, aby z powodzeniem zidentyfikować obszar w komórkach i tkankach, w którym znajdują się antygeny. Technika znakowania cząstkami złota została po raz pierwszy opublikowana przez Faulka, W. i Taylora, G., kiedy byli oni w stanie oznaczyć cząsteczki złota króliczymi globulinami gamma przeciw Salmonelli w jednym kroku w celu zidentyfikowania lokalizacji antygenów salmonelli.

Badania wykazały, że rozmiar cząstki złota musi być powiększony (> 40 nm), aby zobaczyć komórki w małym powiększeniu, ale cząsteczki złota, które są zbyt duże, mogą zmniejszyć skuteczność wiązania złotego znacznika. Naukowcy doszli do wniosku, że użycie mniejszych cząstek złota (1-5 nm) powinno zostać powiększone i wzmocnione srebrem. Chociaż barwienie tetratlenkiem osmu może zarysować srebro, stwierdzono, że wzmocnienie cząstkami złota nie jest podatne na zarysowanie przez barwienie tetratlenkiem osmu; dlatego wiele badań adhezji komórek różnych substratów może wykorzystywać mechanizm znakowania immunologicznego złota poprzez wzmocnienie cząstek złota.

Dalsze zastosowania

Przeprowadzono badania w celu sprawdzenia zgodności znakowania immunologicznego z odciskami palców. Czasami odciski palców nie są wystarczająco wyraźne, aby rozpoznać wzór grzbietu. Znakowanie immunologiczne może być sposobem na zawężenie przez personel medycyny sądowej, kto pozostawił odcisk. Naukowcy przeprowadzili badanie, w którym przetestowali zgodność znakowania immunologicznego z wieloma technikami rozwoju odcisków palców. Odkryli, że indanodion-cynk (IND-ZnCl), IND-ZnCl, a następnie natryskiwanie ninhydryny (IND-NIN), wywoływacz fizyczny (PD), dymiący cyjanoakrylan (CA), cyjanoakrylan, a następnie zasadowe barwienie na żółto (CA-BY), dymiący lumicyjanoakrylan (Lumi-CA) i dymiący policyjanoakrylan (Poly-CA) wszystkie były zgodne ze znakowaniem immunologicznym. Znakowanie immunologiczne może nie tylko wyodrębnić informacje o profilowaniu dawcy z odcisków palców, ale może również poprawić jakość odcisków palców, co byłoby korzystne w przypadku kryminalistyki.

Linki zewnętrzne