linia komórkowa AB9 danio pręgowanego

Komórki AB9 danio pręgowanego to pierwotna linia komórkowa fibroblastów wywodząca się z tkanki płetwy szczepu AB. Komórki te są powszechnie wykorzystywane do badań skupiających się na właściwościach biochemicznych i molekularnych danio pręgowanego . Komórki hoduje się w zmodyfikowanej przez Dulbecco pożywce Eagle'a (DMEM) uzupełnionej 15% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w wilgotnej atmosferze wzbogaconej w 5% C02 w temperaturze 28°C . W tych warunkach komórki pasażowano 1 na 4 podwaja się co 72 godziny, gdy jest karmiony świeżą pożywką hodowlaną w odstępach 3-dniowych.

Pierwotna hodowla komórek embrionalnych fibroblastów danio pręgowanego

Danio pręgowany jest ważnym kręgowcem i stał się ważnym modelem dla genetyki, biologii rozwoju, biologii chemicznej i regeneracji. W celu założenia hodowli komórkowej około 200-300 zarodków szczepu Ab danio pręgowanego w 5-10 stadium somitu odchlorowano przez traktowanie proteazą 300 ul/ml i przemyto PBS. Następnie rozcieńczono w 1:400 w PBS przez 2 minuty i rozbito na małe części za pomocą 0,05% trypsyny/EDTA i umieszczono na płytkach w kolbie 25 cm^2 Collagen I Biocoated. Komórki hodowano w pożywce złożonej z DMEM. Pożywkę dodatkowo wzbogaca się 25 ng/ml ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu. Po drugim pasażu komórki ponownie hodowano w pożywce podobnej do pierwszej z wykluczeniem EGF i bbFGF. Pierwotne fibroblasty zarodkowe danio pręgowanego, ZEF1 i ZEF2 utrzymywano w 29°C i 5% CO 2 przez dwa i trzy miesiące przed transfekcją.

Immunofluorescencja na komórkach AB9

Komórki AB9 inkubowano w 5% CO2 w 28°C i hodowano w szalkach do hodowli tkankowych z pożywką minimalną (DMEM) uzupełnioną 15% inaktywowanym ciepłem FBS i antybiotykami-środkami przeciwgrzybiczymi. Następnie komórki umieszczono na szkiełku nakrywkowym z poli-L-lizyny i pozostawiono do wzrostu do 80-90% konfluencji. Następnie przemyto je zimnym PBS i zawieszono w 4% roztworze paraformaldehydu w PBS na 30 minut w temperaturze pokojowej. Po upływie 30 minut ponownie przemywamy komórki 1X PBS, trzy razy przez pięć minut. Będziemy nakłuwać błonę komórkową 0,2% trytonem w PBS przez 10 minut. Następnie wielokrotnie przemywano 1X PBS i blokowano w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę w 1% BSA w PBS. Pozostawiliśmy na noc, a następnego dnia komórki przemyto trzy razy 1X PBS po pięć minut każda. Po przemyciu komórek inkubujemy z drugorzędowym przeciwciałem przez godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc naszą próbkę przed jakimkolwiek źródłem światła. Następnie przeprowadzono dodatkowe trzy przemywania przez pięć minut 1X PBS i szybkie przemycie dH2O. Komórki AB9 zamontowano za pomocą vectashield i zbadano pod Nikon Eclipse TE2000-U przy 60X.

Testy funkcjonalne w komórkach AB9

Powalenie białka oznacza, że ​​geny organizmu są zredukowane. Aby znokautować AB9, pierwszą rzeczą, którą należy sprawdzić, jest to, czy elektroporacja jest niezawodną metodą wychwytu MO lub antysensownych morfolin. Rozpoczynamy od elektroforezy znakowanej fluoresceiną cx43 MO do komórek AB9, stosując znakowaną fluoresceiną standardową kontrolę MO jako kontrolę. Obserwujemy, że wydajność 50-70%. Następnie testujemy wychwyt MO AB9 prowadzony przez knockdown białka. Lizaty przygotowano z komórek traktowanych krzywą standardową i cx43 Mo przy 25 hpe. Następnie próbujemy ustalić, czy możemy zablokować funkcję białka, traktując AB9 środkami farmakologicznymi. Inhibitorem w tym przypadku będzie Hsp47 i traktujemy komórkę 100 μm inhibitora, stosując kontrolę DMSO.

Linki zewnętrzne

Pobrano z „ https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Zebrafish_AB9_cell_line&oldid=1107929470 ”