Aktywacja transkrypcji kontrolowana tetracykliną

Przykład systemu T-REx kontrolującego ekspresję shRNA

Aktywacja transkrypcji kontrolowana tetracykliną jest metodą indukowalnej ekspresji genów , w której transkrypcja jest odwracalnie włączana lub wyłączana w obecności antybiotyku tetracykliny lub jednej z jej pochodnych (np. doksycykliny ).

Ekspresja genów kontrolowana przez tetracyklinę opiera się na mechanizmie oporności na antybiotyki z grupy tetracyklin występującej u bakterii Gram-ujemnych . W naturze promotor P _tet wyraża TetR, represor i TetA, białko, które wypompowuje antybiotyk tetracyklinowy z komórki.

Różnica między Tet-On i Tet-Off nie polega na tym, czy transaktywator włącza lub wyłącza gen, jak może sugerować nazwa; raczej oba białka aktywują ekspresję. Różnica dotyczy ich odpowiedniej odpowiedzi na tetracyklinę lub doksycyklinę (Dox, bardziej stabilny analog tetracykliny); Tet-Off aktywuje ekspresję pod nieobecność Dox, podczas gdy Tet-On aktywuje się w obecności Dox.

Tet-Off i Tet-On

Dwa najczęściej stosowane indukowalne systemy ekspresyjne do badań biologii komórek eukariotycznych to Tet-Off i Tet-On. System Tet-Off do kontrolowania ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania w komórkach ssaków został opracowany przez profesorów Hermanna Bujarda [ de ] i Manfreda Gossena na Uniwersytecie w Heidelbergu i opublikowany po raz pierwszy w 1992 roku.

System Tet-Off wykorzystuje białko transaktywatora tetracykliny (tTA) , które powstaje w wyniku fuzji jednego białka , TetR (represora tetracykliny), występującego w bakteriach Escherichia coli , z domeną aktywacyjną innego białka, VP16 , występującego w opryszczce wirus simplex .

Powstałe białko tTA jest zdolne do wiązania się z DNA w określonych sekwencjach operatora TetO . W większości systemów Tet-Off kilka powtórzeń takich sekwencji TetO jest umieszczonych powyżej minimalnego promotora, takiego jak promotor CMV. Całość kilku sekwencji TetO z minimalnym promotorem nazywana jest elementem odpowiedzi na tetracyklinę (TRE), ponieważ odpowiada na wiązanie białka transaktywatora tetracykliny tTA poprzez zwiększoną ekspresję genu lub genów poniżej jego promotora.

W systemie Tet-Off ekspresja genów kontrolowanych przez TRE może być tłumiona przez tetracyklinę i jej pochodne. Wiążą tTA i czynią je niezdolnymi do wiązania się z sekwencjami TRE, zapobiegając w ten sposób transaktywacji genów kontrolowanych przez TRE.

System Tet-On działa podobnie, ale w odwrotny sposób. Podczas gdy w systemie Tet-Off tTA jest zdolne do wiązania operatora tylko wtedy, gdy nie jest związane z tetracykliną lub jedną z jej pochodnych, takich jak doksycyklina, w systemie Tet-On białko rtTA jest zdolne do wiązania operatora tylko wtedy, gdy jest związane przez tetracyklinę. Tak więc wprowadzenie do ustroju doksycykliny inicjuje transkrypcję produktu genetycznego. System Tet-On jest czasami preferowany w stosunku do Tet-Off ze względu na szybszą reakcję.

Systemy ekspresyjne Tet-Off stosuje się również do wytwarzania myszy transgenicznych, które warunkowo eksprymują gen będący przedmiotem zainteresowania.

Tet-On Advanced i Tet-On 3G

Zaawansowany transaktywator Tet-On (znany również jako rtTA2 ^S -M2) jest alternatywną wersją Tet-On, która wykazuje zmniejszoną podstawową ekspresję i działa przy 10-krotnie niższym stężeniu Dox niż Tet-Off. Ponadto uważa się, że jego ekspresja jest bardziej stabilna w komórkach eukariotycznych ze względu na optymalizację ludzkich kodonów i wykorzystanie trzech minimalnych domen aktywacji transkrypcji. Został odkryty w 2000 roku jako jeden z dwóch ulepszonych mutantów przez H. Bujarda i jego współpracowników po losowej mutagenezie części represora Tet genu transaktywatora. Tet-On 3G (znany również jako rtTA-V10) jest podobny do Tet-On Advanced, ale wywodzi się z rtTA2 ^S -S2 zamiast rtTA2 ^S -M2. Jest również zoptymalizowany pod względem kodonów ludzkich i składa się z trzech minimalnych domen aktywacyjnych VP16. Jednak białko Tet-On 3G ma pięć różnic aminokwasowych w porównaniu z Tet-On Advanced, co wydaje się jeszcze bardziej zwiększać jego wrażliwość na Dox. Tet-On 3G jest wrażliwy na 100-krotnie mniej Dox i jest siedmiokrotnie bardziej aktywny niż oryginalny Tet-On.

Inne systemy

Inne systemy, takie jak system T-REx firmy Life Technologies, działają w inny sposób. Gen będący przedmiotem zainteresowania jest oflankowany przez promotor CMV w górę i dwa miejsca TetO2. Ekspresja genu będącego przedmiotem zainteresowania jest tłumiona przez wiązanie homodimerów TetR z wysokim powinowactwem do każdej sekwencji TetO2 pod nieobecność tetracykliny. Wprowadzenie tetracykliny skutkuje związaniem jednej tetracykliny na każdym homodimerze TetR, a następnie uwolnieniem TetO2 przez homodimery TetR. Niewiązanie homodimerów TetR i TetO2 powoduje derepresję genu będącego przedmiotem zainteresowania.

Zmodyfikowana wersja T-REx to syntetyczny obwód biologiczny Linearizer , zoptymalizowany pod kątem regulacji ekspresji genów w komórkach eukariotycznych (pączkujące drożdże, ludzkie itp.). Włączając miejsca TetO2 do promotora kierującego ekspresją TetR, tworzy ujemne sprzężenie zwrotne , co zapewnia jednorodną ekspresję (niski poziom szumów) i liniową odpowiedź na dawkę w stosunku do analogów tetracykliny.

Element odpowiedzi na tetracyklinę (TRE)

W najczęściej stosowanych plazmidach element odpowiedzi na tetracyklinę składa się z siedmiu powtórzeń bakteryjnej sekwencji TetO o wielkości 19 bp (TCCCTATCAGTGATAGAGA) oddzielonych sekwencjami rozdzielającymi (na przykład: ACGATGTCGAGTTTAC). To TetO jest rozpoznawane i wiązane przez część TetR Tet-On lub Tet-Off. TRE jest zwykle umieszczany powyżej minimalnego promotora, który ma bardzo niską podstawową ekspresję przy braku związanego Tet-Off (lub Tet-On).

Zalety i wady

System Tet ma przewagę nad warunkowymi systemami ekspresji genów Cre , FRT i ER (receptor estrogenowy). W systemach Cre i FRT aktywacja lub nokaut genu jest nieodwracalna po zakończeniu rekombinacji, podczas gdy w systemach Tet i ER jest odwracalna. System Tet ma bardzo ścisłą kontrolę ekspresji, podczas gdy system ER jest nieco nieszczelny. Jednak system Tet, który zależy od transkrypcji, a następnie translacji docelowego genu, nie działa tak szybko jak system ER, który stabilizuje już eksprymowane białko docelowe po podaniu hormonu. Ponadto, ponieważ sekwencja tet-o o długości 19 pz jest naturalnie nieobecna w komórkach ssaków, plejotropia jest zminimalizowana w porównaniu z hormonalnymi metodami kontroli. W przypadku stosowania systemu Tet w hodowli komórkowej ważne jest, aby potwierdzić, że każda partia płodowej surowicy bydlęcej jest testowana w celu potwierdzenia, że zanieczyszczające tetracykliny są nieobecne lub są zbyt niskie, aby zakłócać indukowalność.

Mechanizm działania przeciwbakteryjnego działania tetracyklin polega na zakłócaniu translacji białek w bakteriach, uszkadzając w ten sposób zdolność drobnoustrojów do wzrostu i naprawy; jednak translacja białek jest również zakłócona w mitochondriach eukariotycznych , co prowadzi do efektów, które mogą zakłócić wyniki eksperymentów.

Zobacz też

Linki zewnętrzne