Anty-CRISPR
| anty-CRISPR (białko AcrIIA4) | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
 uzyskana z PDB za pomocą przeglądarki JSmol.
| |||||||
| Identyfikatory | |||||||
| Organizm | |||||||
| Symbol | AcrIIA4 | ||||||
| WPB | 5XN4 | ||||||
| UniProt | A0A247D711 | ||||||
| |||||||
Anty-CRISPR (Anti-Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats lub Acr) to grupa białek znajdujących się w fagach , które hamują normalną aktywność CRISPR -Cas, układu odpornościowego niektórych bakterii . CRISPR składa się z genomowych , które można znaleźć w organizmach prokariotycznych , które pochodzą z bakteriofagów , które wcześniej zainfekowały bakterie i są wykorzystywane do obrony komórki przed dalszymi atakami wirusów. Anty-CRISPR wynika z procesu ewolucyjnego zachodzącego w fagach, aby uniknąć zniszczenia ich genomów przez komórki prokariotyczne , które zakażą.
Przed odkryciem tego typu białek rodzinnych nabycie mutacji było jedynym znanym sposobem, jaki fagi mogły wykorzystać, aby uniknąć rozbicia, w którym pośredniczy CRISPR-Cas , poprzez zmniejszenie powinowactwa wiązania faga i CRISPR. Niemniej jednak bakterie mają mechanizmy ponownego kierowania zmutowanego bakteriofaga, proces, który nazywa się „adaptacją torującą”. Tak więc, o ile naukowcy wiedzą obecnie, anty-CRISPR jest najskuteczniejszym sposobem zapewnienia przetrwania fagów w całym procesie infekcji bakteryjnej.
Historia
Systemy anty-CRISPR po raz pierwszy zaobserwowano w profagach Pseudomonas aeruginosa , które dezaktywowały system CRISPR-Cas typu IF, charakterystyczny dla niektórych szczepów tych bakterii. Po przeanalizowaniu sekwencji genomowych tych fagów odkryto geny kodujące pięć różnych białek anty-CRISPR (zwanych także Acrs). Takimi białkami były AcrF1 , AcrF2 , AcrF3 , AcrF4 i AcrF5 . Badania wykazały, że żadne z tych białek nie zakłóciło ekspresji genów Cas ani składania cząsteczek CRISPR, więc sądzono, że te białka typu IF bezpośrednio wpłynęły na interferencję CRISPR-Cas.
Dalsze badania potwierdziły tę hipotezę wraz z odkryciem 4 innych białek ( AcrE1 , AcrE2 , AcrE3 i AcrE4 ), które, jak wykazano, utrudniają system CRISPR-Cas Pseudomonas aeruginosa . Co więcej, locus genów kodujących te białka typu IE było bardzo zbliżone do locus odpowiedzialnego za ekspresję białek typu IF w tej samej grupie fagów, co prowadziło do wniosku, że oba typy białek działają razem. Jednak te pierwsze dziewięć białek nie miało wspólnych motywów sekwencji , co ułatwiłoby identyfikację nowych rodzin białek anty-CRISPR.
Później okazało się, że fagi wytwarzające takie białka również kodowały domniemany regulator transkrypcji o nazwie Aca 1 (anty-CRISPR Associated 1), który był genetycznie zlokalizowany bardzo blisko genów anty-CRISPR. To białko regulatorowe ma być odpowiedzialne za ekspresję genu anty-CRISPR podczas cyklu infekcyjnego faga, dlatego oba rodzaje białek (anty-CRISPR i Aca1) wydają się działać razem jako jeden mechanizm.
sekwencję aminokwasów podobną do sekwencji Aca1, co doprowadziło do odkrycia Aca2 , nowej rodziny białek Aca. Aca2 ujawniło również istnienie pięciu nowych grup białek anty-CRISPR typu IF ze względu na ich bliskość genomową: AcrF6 , AcrF7 , AcrF8 , AcrF9 i AcrF10 . Białka te były obecne nie tylko w Pseudomonas aeruginosa , ale także wpływały na inne komórki Pseudomonadota ( dawniej Proteobacteria ).
Dzięki wykorzystaniu narzędzi bioinformatycznych w 2016 roku odkryto rodziny białek AcrIIC1 , AcrIIC2 i AcrIIC3 u Neisseria meningitidis (wcześniej zakażonej przez fagi). Takie białka były pierwszymi znalezionymi inhibitorami CRISPR-Cas typu II (konkretnie hamowały II-C CRISPR-Cas9, rodzaj mechanizmu stosowanego w genetycznej edycji ludzkich komórek). Rok później badania potwierdziły obecność inhibitorów CRISPR-Cas9 typu II-A ( AcrIIA1 , AcrIIA2 , AcrIIA3 i AcrIIA4 ) w Listeria monocytogenes (zakażonej przez bakteriofagi, które wprowadziły białka anty-CRISPR). Wykazano, że dwa z tych białek (AcrIIA2 i AcrIIA4) działają prawidłowo przeciwko Streptococcus pyogenes typu II-A.
Rezultatem wszystkich tych badań było odkrycie 21 różnych rodzin białek anty-CRISPR, mimo że mogą istnieć inne inhibitory z powodu szybkiego procesu mutacji fagów. Dlatego potrzebne są dalsze badania, aby odkryć złożoność systemów anty-CRISPR.
typy
Geny anty-CRISPR można znaleźć w różnych częściach DNA faga: w kapsydzie, ogonie i na skrajnym końcu. Ponadto stwierdzono, że wiele MGE ma dwa lub nawet trzy geny Acr w jednym operonie , co sugeruje, że mogły one zostać wymienione między MGE.
Jak wszystkie białka, białka z rodziny Acr powstają w wyniku translacji i transdukcji genów, a ich klasyfikacja opiera się na rodzaju układu CRISPR-Cas, który hamują, ze względu na fakt, że każde białko anty-CRISPR hamuje określony CRISPR-Cas system. Chociaż nie odkryto zbyt wielu białek anty-CRISPR, oto te, które odkryto do tej pory:
| Rodzina białek anty-CRISPR | Charakteryzowany członek | Zablokowany system CRISPR | Liczba aminokwasów |
|---|---|---|---|
| AcrE1 | JBD5‑34 ( Pseudomonas aeruginosa ) | TJ | 100 |
| AcrE2 | JBD88a-32 ( P. aeruginosa ) | TJ | 84 |
| AcrE3 | DMS3-30 ( P. aeruginosa ) | TJ | 68 |
| AcrE4 | D3112-31 ( P. aeruginosa ) | TJ | 52 |
| AcrF1 | JBD30-35 ( P. aeruginosa ) | JEŚLI | 78 |
| AcrF2 | D3112-30 ( P. aeruginosa ) | JEŚLI | 90 |
| AcrF3 | JBD5-35 ( P. aeruginosa ) | JEŚLI | 139 |
| AcrF4 | JBD26-37 ( P. aeruginosa ) | JEŚLI | 100 |
| AcrF5 | JBD5-36 ( P. aeruginosa ) | JEŚLI | 79 |
| AcrF6 | AcrF6 Pae ( P. aeruginosa ) | I-E i I-F | 100 |
| AcrF7 | AcrF7 Pae ( P. aeruginosa ) | JEŚLI | 67 |
| AcrF8 | AcrF8 ZF40 ( fag Pectobacterium ZF40) | JEŚLI | 92 |
| AcrF9 | AcrF9 Vpa ( Vibrio parahaemolyticus ) | JEŚLI | 68 |
| AcrF10 | AcrF10 Sxi ( Shewanella xiamenensis ) | JEŚLI | 97 |
| AcrIIA1 | AcrIIA1 Lmo ( Listeria monocytogenes ) | II‑A | 149 |
| AcrIIA2 | AcrIIA2 Lmo ( L. monocytogenes ) | II‑A | 123 |
| AcrIIA3 | AcrIIA3 Lmo ( L. monocytogenes ) | II‑A | 125 |
| AcrIIA4 | AcrIIA4 Lmo ( L. monocytogenes ) | II‑A | 87 |
| AcrIIC1 | AcrIIC1 Nme ( Neisseria meningitidis ) | II‑C | 85 |
| AcrIIC2 | AcrIIC2 Nme ( N. meningitidis ) | II‑C | 123 |
| AcrIIC3 | AcrIIC3 Nme ( N. meningitidis ) | II‑C | 116 |
Do tej pory geny kodujące białka anty-CRISPR znaleziono w myofagach , syfofagach , domniemanych elementach koniugacyjnych i wyspach patogenności .
Podejmowano próby znalezienia wspólnych otaczających cech genetycznych genów anty-CRISPR, ale bez powodzenia. Niemniej jednak zaobserwowano obecność genu aca tuż poniżej genów anty-CRISPR.
Pierwszymi odkrytymi rodzinami białek Acr były AcrF1, AcrF2, AcrF3, AcrF4 i AcrF5. Inhibitory te występują głównie w Pseudomonas , które są zdolne do infekowania Pseudomonas aeruginosas posiadających system CRISPR-Cas typu I‑F. Następnie w innym badaniu stwierdzono, że rodziny białek AcrE1, AcrE2, AcrE3 i AcrE4 również hamują CRISPR-Cas typu I‑F w Pseudomonas aeruginosas.
Później stwierdzono, że rodziny białek AcrF6, AcrF7, AcrF8, AcrF9 i AcrF10, które były również zdolne do hamowania CRISPR-Cas typu I-F, były bardzo powszechne w Pseudomonadota MGE .
Odkryto wówczas pierwsze inhibitory układu CRISPR-Cas typu II: AcrIIC1, AcrIIC2 i AcrIIC3, które blokują aktywność Neisseria meningitidis typu II-C CRISPR-Cas9 .
Ostatecznie znaleziono AcrIIA1, AcrIIA2, AcrIIA3 i AcrIIA4. Te rodziny białek mają zdolność hamowania systemu CRISPR-Cas typu II-A Listeria monocytogenes .
Jeśli chodzi o konwencję nazewnictwa białek z rodziny Acr, ustala się ją w następujący sposób: po pierwsze rodzaj układu hamowanego, następnie wartość liczbowa odnosząca się do rodziny białek, a na końcu źródło konkretnego białka anty-CRISPR. Na przykład AcrF9 Vpa jest aktywny przeciwko systemowi CRISPR-Cas typu IF. Był to również dziewiąty anty-CRISPR opisany dla tego systemu i jest zakodowany w zintegrowanym MGE w Vibrio parahaemolyticus .
Struktura
Jak ujawniono powyżej, istnieje szerokie spektrum białek anty-CRISPR, ale niewiele z nich zostało dogłębnie zbadanych. Jednym z najlepiej zbadanych i najlepiej zdefiniowanych Acrs jest AcrIIA4, który hamuje Cas9, blokując w ten sposób system II-A CRISPR-Cas Streptococcus pyogenes .
AcrIIA4
Struktura AcrIIA4 uzyskana za pomocą oprogramowania UCSF Chimera, do którego przesłano plik PDB. Czterem różnym strukturom drugorzędowym występującym w tym białku przypisano różne kolory: niebieski dla nici β, czerwony dla α-helisy, pomarańczowy dla helisy 3 10 i szary dla pętli. Oryginalnie plik PDB zawiera 20 sekwencji o najniższej energii (a tym samym najbardziej stabilnych) nałożonych na siebie, z których jedna została losowo wybrana do utworzenia figury. Białko rozwiązano za pomocą magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR); zawiera 87 reszt, a jego masa cząsteczkowa wynosi 10,182 kDa. AcrIIA4 zawiera:
- 3 antyrównoległe nici β (pierwsza od reszt 16 do 19, druga od 29 do 33 i trzecia od 40 do 44), które tworzą arkusz β. Stanowi to 16,1% całkowitej liczby aminokwasów, ponieważ 14 z nich tworzy nici β.
- 3 α-helisy (pierwsza, 2-13 reszt, druga, 50-59 reszt i trzecia, 68-85 reszt).
- 1 3 10 helisa umieszczona pomiędzy pierwszą (β1) a drugą (β2) nicią β, która zaczyna się na reszcie 22 i kończy na reszcie 25. Cała helisa składa się z 40 reszt, co stanowi 50,6% białko.
- Pętle łączące różne struktury drugorzędowe.
Istnieje dobra definicja struktur drugorzędowych, ponieważ trzy helisy α są upakowane w pobliżu trzech nici β. Co uderzające, między nicią β3, helisami α2 i α3 znajduje się hydrofobowy rdzeń, pochodzący z klastra aromatycznych łańcuchów bocznych, które są przyciągane przez oddziaływania niekowalencyjne, takie jak układanie pi . Ponadto, ponieważ jest białkiem kwasowym, w pętlach między β3 a α2, między α2 a α3 oraz w pierwszej części α3 występuje duże stężenie ujemnie naładowanych reszt, które mogą odgrywać ważną rolę w hamowaniu Cas9 , ponieważ ładunki ujemne mogą imitować fosforany kwasów nukleinowych.
AcrF1
Z drugiej strony istnieje inny Acr, AcrF1, który być może nie został zbadany tak, jak wyjaśniono powyżej, chociaż istnieje dobry opis jego struktury. Hamuje system IF CRISPR-Cas Pseudomonas aeruginosa . Maxwell i in. rozwiązał strukturę 3D za pomocą NMR.
Białko zawiera 78 reszt, między którymi współdziałają, tworząc struktury drugorzędowe. Struktura AcrF1 składa się z dwóch antyrównoległych α-helis i β-kartki, która zawiera cztery antyrównoległe β-nici. Ten arkusz β jest umieszczony po przeciwnej stronie części α-helikalnej, która tworzy hydrofobowy rdzeń utworzony z 13 aminokwasów. Zwoje można również znaleźć w różnych częściach białka, na przykład łącząc nici β.
Istnieją reszty powierzchniowe, które aktywnie uczestniczą w miejscu aktywnym AcrF1, z których dwie to tyrozyny (Y6 i Y20), a trzecim aminokwasem jest kwas glutaminowy (E31), ponieważ ich mutacja przez alaninę powoduje 100-krotny spadek aktywność białka (z mutacjami Y20A i E31A) oraz 10 7 -krotny spadek, gdy Y6 jest zmutowany.
Różne struktury tworzące białko tworzą dziwną kombinację, jak twierdzi Maxwell i in. przeprowadzili wyszukiwanie DALI w celu znalezienia podobieństw między innymi białkami i nie znaleźli żadnych podobieństw informacyjnych.
Funkcjonować
Unikanie zniszczenia DNA faga
Główną funkcją białek anty-CRISPR jest interakcja z określonymi składnikami systemów CRISPR-Cas, takimi jak nukleazy efektorowe , aby uniknąć zniszczenia DNA faga (poprzez wiązanie lub cięcie).
Fag wprowadza swoje DNA do komórki prokariotycznej, zwykle komórka wykrywa sekwencję zwaną „celem”, która aktywuje układ odpornościowy CRISPR-Cas, ale obecność początkowej sekwencji (przed celem) kodującej tworzenie białek Acr, unika niszczenie fagów. Białka Acr powstają przed odczytaniem sekwencji docelowej. W ten sposób system CRISPR-Cas zostaje zablokowany, zanim będzie mógł opracować odpowiedź.
Procedura rozpoczyna się transkrypcją locus CRISPR na crRNA (CRISPR RNA). CrRNA łączą się z białkami Cas, tworząc kompleks rybonukleoproteinowy o nazwie Cascade. Ten kompleks bada komórkę w celu znalezienia komplementarnych sekwencji crRNA. Kiedy ta sekwencja zostanie znaleziona, nukleaza Cas3 jest rekrutowana do kaskady, a docelowy DNA z faga jest cięty. Ale na przykład, gdy zostaną znalezione AcrF1 i AcrF2 (białka anty-CRISPR), oddziałują one odpowiednio z Cas7f i Cas8f-Cas5f, nie pozwalając na wiązanie się z DNA faga. Ponadto rozszczepieniu celu zapobiega połączenie między AcrF3 i Cas3.
Większość genów Acr znajduje się obok genów anty-CRISPR-associated (Aca), które kodują białka z motywem wiążącym DNA helisa-zwrot-helisa. Geny Aca są zachowane i naukowcy wykorzystują je do identyfikacji genów Acr, ale funkcja kodowanych przez nie białek nie jest całkowicie jasna. Promotor związany z Acr wytwarza wysokie poziomy transkrypcji Acr tuż po wstrzyknięciu DNA faga do bakterii, a następnie białka Aca hamują transkrypcję. Gdyby to nie zostało stłumione, ciągła transkrypcja genu byłaby zabójcza dla faga. Dlatego aktywność Aca jest niezbędna do zapewnienia jej przetrwania.
Współpraca fag-fag
Ponadto potwierdzono, że bakterie z systemami CRISPR-Cas są nadal częściowo odporne na Acr. W związku z tym początkowe nieudane infekcje fagowe mogą nie być w stanie zahamować odporności CRISPR, ale współpraca fag-fag może w coraz większym stopniu zwiększać produkcję Acr i promować immunosupresję, co może powodować wzrost podatności komórki gospodarza na ponowną infekcję, a ostatecznie pozwolić na udaną infekcję i rozprzestrzenianie się drugiego faga. Ta współpraca tworzy epidemiologiczny punkt krytyczny, w którym, w zależności od początkowej gęstości fagów Acr i siły wiązania CRISPR/Acr, fagi mogą zostać wyeliminowane lub zapoczątkować epidemię fagów (liczba bakteriofagów jest wzmocniona).
Jeśli początkowe poziomy fagów są wystarczająco wysokie, zagęszczenie gospodarzy z obniżoną odpornością osiąga punkt krytyczny, w którym jest więcej udanych infekcji niż nieudanych. Wtedy zaczyna się epidemia. Jeśli ten punkt nie zostanie osiągnięty, następuje wyginięcie faga, a gospodarze z obniżoną odpornością odzyskują swój stan początkowy.
Unikanie odporności na fagi
Stało się jasne, że białka Acr odgrywają ważną rolę w umożliwianiu unikania odporności fagów, chociaż nadal nie jest jasne, w jaki sposób synteza białek anty-CRISPR może pokonać system CRISPR-Cas gospodarza, który może rozbić genom faga w ciągu kilku minut po infekcji.
Mechanizmy
W obrębie wszystkich dotychczas odkrytych białek Anty-CRISPR opisano mechanizmy tylko dla 15 z nich. Mechanizmy te można podzielić na trzy różne typy: interferencja ładowania crRNA, blokada wiązania DNA i zapobieganie rozszczepianiu DNA.
Zakłócenia ładowania CrRNA
Mechanizm interferencji ładowania CrRNA (CRISPR RNA) jest związany głównie z rodziną białek AcrIIC2. Aby zablokować Cas9 , uniemożliwia prawidłowe złożenie kompleksu crRNA-Cas9.
Blokada wiązania DNA
Wykazano, że AcrIIC2 nie jest jedynym zdolnym do blokowania wiązania DNA. Istnieje 11 innych białek z rodziny Acr, które również mogą to przeprowadzić. Niektóre z nich to AcrIF1, AcrIF2 i AcrIF10, które działają na różne podjednostki kaskadowego kompleksu efektorowego systemu CRISPR-Cas typu I-F, zapobiegając wiązaniu się DNA z kompleksem.
Ponadto AcrIIC3 zapobiega wiązaniu DNA poprzez promowanie dimeryzacji DNA naśladującego Cas9 i AcrIIA2, blokując w ten sposób reszty rozpoznawane przez PAM , aw konsekwencji zapobiegając rozpoznawaniu i wiązaniu dsDNA (dwuniciowego DNA) .
Zapobieganie rozszczepianiu DNA
AcrE1, AcrIF3 i AcrIIC1 mogą zapobiegać cięciu docelowego DNA. Za pomocą krystalografii rentgenowskiej odkryto, że AcrE1 wiąże się z Cas3 związanym z CRISPR. Podobnie analiza biochemiczna i strukturalna AcrIF3 wykazała jego zdolność wiązania się z Cas3 jako dimerem, aby zapobiec rekrutacji Cas3 do kompleksu Cascade. Wreszcie, dzięki biochemicznym i strukturalnym badaniom AcrIIC1 stwierdzono, że wiąże się on z miejscem aktywnym domeny endonukleazy HNH w Cas9, co zapobiega rozszczepianiu DNA. W ten sposób zamienia Cas9 w stan nieaktywny, ale związany z DNA.
Aplikacje
Zmniejszenie cięć CRISPR-Cas9 poza celem
AcrIIA4 jest jednym z białek odpowiedzialnych za hamowanie układu CRISPR-Cas9, mechanizmu stosowanego w edycji komórek ssaków. Dodatek AcrIIA4 w ludzkich komórkach pozwala uniknąć interakcji Cas9 z systemem CRISPR, zmniejszając jego zdolność do cięcia DNA. Jednak różne badania doprowadziły do wniosku, że dodanie go w małych proporcjach po zakończeniu edycji genomu zmniejsza liczbę cięć poza celem w konkretnych miejscach, w których Cas9 oddziałuje, co sprawia, że cały system jest znacznie bardziej precyzyjny.
Unikanie konsekwencji ekologicznych
Jednym z głównych celów wykorzystania technologii CRISPR-Cas9 jest eliminacja chorób, z których część znajduje się w wektorach chorób , takich jak komary. Białka anty-CRISPR mogą utrudniać napęd genów , co może mieć niepewne i katastrofalne konsekwencje w ekosystemach .
Wykryj obecność Cas9 w próbce
Aby wiedzieć, czy dana bakteria syntetyzuje Cas9, a zatem wykorzystuje CRISPR-Cas9, lub wykryć przypadkowe lub niedozwolone użycie tego systemu, można użyć AcrIIC1. Ponieważ wspomniane białko wiąże się z Cas9, zaprojektowano odśrodkową platformę mikroprzepływową do jego wykrywania i określania jego aktywności katalitycznej.
Terapia fagowa
Oporność na antybiotyki jest problemem zdrowia publicznego, który stale rośnie z powodu złego stosowania antybiotyków. Terapia fagowa polega na zakażaniu bakterii za pomocą fagów, które są znacznie bardziej specyficzne i powodują mniej skutków ubocznych niż antybiotyki. Acrs może hamować system CRISPR-Cas9 niektórych bakterii i umożliwiać tym fagom infekowanie komórek bakteryjnych bez atakowania ich układu odpornościowego.