Lizat amebocytów Limulusa

Podkowiasty krab atlantycki Limulus polyphemus .

Limulus amebocyte lysate ( LAL ) jest wodnym ekstraktem krwinek ( amebocytów ) z podkowca atlantyckiego Limulus polyphemus . LAL reaguje z bakteryjnym lipopolisacharydem endotoksyny (LPS), który jest składnikiem błony bakterii Gram-ujemnych . Ta reakcja jest podstawą testu LAL , który jest szeroko stosowany do wykrywania i oznaczania ilościowego endotoksyn bakteryjnych .

czasami zamiast tego stosuje się podobny test lizatu amebocytów Tachypleus ( TAL ) oparty na lokalnych krabach podkowiastych Tachypleus gigas lub Tachypleus tridentatus . Test rekombinowanego czynnika C (rFC) zastępuje LAL /TAL w oparciu o podobną reakcję.

Tło

Amerykański naukowiec medyczny Fred Bang poinformował w 1956 r., Że bakterie Gram-ujemne, nawet jeśli zostaną zabite, spowodują, że krew podkowiastego zmieni się w półstałą masę. Później odkryto, że komórki krwi zwierzęcia, ruchome komórki zwane amebocytami , zawierają granulki z czynnikiem krzepnięcia znanym jako koagulogen ; jest to uwalniane na zewnątrz komórki, gdy napotyka się endotoksynę bakteryjną. że powstająca koagulacja (żelowanie) zawiera infekcje bakteryjne w półzamkniętym układzie krążenia zwierzęcia . Nowoczesna analiza lizatu doprowadziła do zrozumienia tego systemu kaskadowego, w którym wiele enzymów działa kolejno w celu wytworzenia żelu. Punktem wejścia krzepnięcia wywołanego endotoksynami jest czynnik krzepnięcia Limulus C.

W 1977 roku Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) zatwierdziła LAL do testowania leków, produktów i urządzeń mających kontakt z krwią. Przed tą datą stosowano w tym celu znacznie wolniejsze i droższe testy na królikach .

Zbiera się podkowiaste kraby i usuwa krew z osierdzia podkowiastego ; kraby są następnie wracane do wody. Producenci LAL zmierzyli śmiertelność krabów na poziomie 3%; jednak ostatnie badania wskazują, że liczba ta może być bliższa 15%, a nawet 30%. Komórki krwi są oddzielane od surowicy za pomocą wirowania , a następnie umieszczane w wodzie destylowanej, co powoduje ich pęcznienie i pękanie („liza”). To uwalnia chemikalia z wnętrza komórki („lizat”), która jest następnie oczyszczana i liofilizowana . Aby przetestować próbkę na obecność endotoksyn, miesza się ją z lizatem i wodą; endotoksyny są obecne, jeśli występuje koagulacja.

Test LAL

Istnieją trzy podstawowe metodologie: żel-skrzep, turbidymetryczna i chromogeniczna. Podstawowym zastosowaniem LAL jest testowanie pozajelitowych środków farmaceutycznych i urządzeń medycznych, które mają kontakt z krwią lub płynem mózgowo-rdzeniowym . W Stanach Zjednoczonych FDA opublikowała wytyczne dotyczące walidacji testu LAL jako testu endotoksyn dla takich produktów.

Kaskada LAL jest również wyzwalana przez (1,3)-β-D-glukan poprzez inny czynnik G. Zarówno endotoksyny bakteryjne, jak i (1,3)-β-D-glukan są uważane za wzorce molekularne związane z patogenami lub PAMP , substancje wywołujące reakcje zapalne u ssaków .

Przezwyciężanie zahamowań i wzmacnianie

Jednym z najbardziej czasochłonnych aspektów badania endotoksyn przy użyciu LAL jest wstępna obróbka próbek w celu przezwyciężenia hamowania testu, które może zakłócać test LAL w taki sposób, że ma to wpływ na odzyskiwanie endotoksyny. Jeśli testowany produkt powoduje, że odzysk endotoksyn jest mniejszy niż oczekiwano, oznacza to, że produkt hamuje test LAL. Wzbogacają się produkty, które powodują wyższe niż oczekiwane wartości. Przezwyciężenie właściwości hamujących i wzmacniających produktu jest wymagane przez FDA jako część walidacji testu LAL do stosowania w testach ostatecznego uwalniania preparatów do wstrzykiwań i wyrobów medycznych. Przed użyciem LAL do uwolnienia produktu należy udowodnić prawidłowe odzyskiwanie endotoksyn.

Alternatywy

Rekombinowany czynnik C

Test LAL jest głównym źródłem zależności od produktów pochodzenia zwierzęcego w przemyśle biomedycznym i wyzwaniem dla zasady 3R nauki w odniesieniu do wykorzystywania zwierząt w testach. W związku z doniesieniami o wyższych niż przewidywano wskaźnikach śmiertelności uznano za bardziej etyczne opracowanie alternatyw dla testu. Pomysł, że odejście od LAL w celu ograniczenia wykorzystania podkowcowatych pomoże w wysiłkach na rzecz ochrony , powinien zostać dokładnie przeanalizowany, ponieważ przejście na rFC może przynieść skutki odwrotne do zamierzonych, zagrażając wysiłkom ochronnym, o które wielu walczyło. ^{[ potrzebne źródło ]} Od 2003 r. na rynku dostępny jest rekombinowany substytut białka do stosowania w teście LAL. Nazwany rekombinowanego czynnika C (rFC), opiera się na tym samym białku czynnika krzepnięcia Limulus C , wytwarzanym przez genetycznie zmodyfikowane komórki owadzie. (Wykorzystana specyficzna sekwencja czynnika C niekoniecznie pochodzi od podkowca atlantyckiego).

Zamiast emulować cały szlak krzepnięcia, testy rFC pozwalają czynnikowi C rozszczepić cząsteczkę fluorogenną, dzięki czemu próbka zapala się, gdy endotoksyna aktywuje czynnik. Ponieważ nie zawiera czynnika G, (1,3)-β-D-glukan nie spowoduje wyników fałszywie dodatnich . Od 2018 roku dostępne dowody wskazują, że test rFC nie jest gorszy niż test LAL.

Przyjmowanie testu rFC było powolne, co zaczęło się zmieniać w 2012 r., kiedy amerykańska FDA i europejskie ministerstwo zdrowia uznały go za akceptowaną alternatywę. Brak wzmianki o nim w Farmakopeach pozostawał problemem, ponieważ nie było dobrego standardu przeprowadzania testu w produkcji. W 2016 roku została dodana do Farmakopei Europejskiej . Patent na rFC również ograniczał przyjęcie do czasu jego wygaśnięcia w 2018 roku.

W dniu 1 czerwca 2020 r. Farmakopea Stanów Zjednoczonych (USP) podjęła decyzję o anulowaniu propozycji włączenia technologii rekombinacji do badania endotoksyn w rozdziale <85> Endotoksyny bakteryjne i rozpoczęciu opracowywania oddzielnego rozdziału, który rozszerza zastosowanie, walidację i porównywalność testy endotoksynowe oparte na odczynnikach pochodzenia rekombinacyjnego. USP zaproponował tylko osobny rozdział 1085.1, chociaż komentarze i opinie opublikowane 11 grudnia 2020 r. Pokazują, że firmy farmaceutyczne i FDA nie popierają tego rozdziału i proszą o status kompendium.

Test aktywacji monocytów

Test aktywacji monocytów (MAT) to kolejna proponowana metoda badania endotoksyn na podstawie monocytów w ludzkiej krwi . Mierzy uwalnianie cytokin z nich z powodu obecności pirogenów , zasadniczo odzwierciedlając proces, w którym te toksyny powodują gorączkę u ludzi (i królików, jak w oryginalnym teście pirogennym). Protokół testu MAT z wykorzystaniem hodowanych komórek jest opisany w Farmakopei Europejskiej.

Niedawne badanie wykorzystujące genetycznie zmodyfikowane monocyty było w stanie znacznie zwiększyć czułość testów wykrywających opartych na monocytach, skracając czas zakończenia testu z ponad 20 godzin do 2–3 godzin.

Zobacz też

Linki zewnętrzne