Trwałe znakowanie izotopowe przez aminokwasy w hodowli komórkowej
Stabilne znakowanie izotopowe przez/z aminokwasami w hodowli komórkowej ( SILAC ) to technika oparta na spektrometrii mas , która wykrywa różnice w obfitości białka między próbkami przy użyciu nieradioaktywnego znakowania izotopowego . Jest to popularna metoda proteomiki ilościowej .
Procedura
hodowli komórkowej hoduje się dwie populacje komórek . Jedna z populacji komórek jest karmiona pożywką wzrostową zawierającą normalne aminokwasy . Natomiast druga populacja jest karmiona pożywką zawierającą aminokwasy znakowane stabilnymi (nieradioaktywnymi) ciężkimi izotopami . Na przykład podłoże może zawierać argininę oznaczoną sześcioma atomami węgla-13 ( 13 C) zamiast zwykłego węgla-12 ( 12 C). Kiedy komórki rosną w tej pożywce, włączają ciężką argininę do wszystkich swoich białek. Następnie wszystkie peptydy zawierające pojedynczą argininę są o 6 Da cięższe niż ich normalne odpowiedniki. Alternatywnie można zastosować jednolite oznakowanie 13 C lub 15 N. Białka z obu populacji komórek łączy się i analizuje razem za pomocą spektrometrii mas ponieważ pary chemicznie identycznych peptydów o różnym składzie stabilnych izotopów można rozróżnić w spektrometrze mas dzięki ich różnicy mas. Stosunek intensywności pików w widmie masowym dla takich par peptydów odzwierciedla stosunek obfitości dla dwóch białek.
Aplikacje
Podejście SILAC obejmujące włączenie tyrozyny znakowanej dziewięcioma atomami węgla-13 ( 13C ) zamiast normalnego węgla-12 ( 12C ) zostało wykorzystane do badania substratów kinazy tyrozynowej w szlakach sygnałowych. SILAC okazał się bardzo potężną metodą badania sygnalizacji komórkowej , modyfikacji posttranslacyjnych, takich jak fosforylacja , interakcje białko-białko i regulacja ekspresji genów . Ponadto SILAC stał się ważną metodą w sekretomice , globalne badanie wydzielanych białek i szlaków sekrecyjnych. Może być używany do rozróżniania białek wydzielanych przez komórki w hodowli i zanieczyszczeń surowicy. Opublikowano również znormalizowane protokoły SILAC dla różnych zastosowań.
Podczas gdy SILAC był głównie używany do badania komórek eukariotycznych i hodowli komórkowych, ostatnio został zastosowany w bakteriach i ich wielokomórkowym biofilmie w tolerancji na antybiotyki, aby różnicować tolerancję i wrażliwe subpopulacje.
Pulsacyjny SILAC
Pulsacyjny SILAC (pSILAC) jest odmianą metody SILAC, w której znakowane aminokwasy są dodawane do pożywki wzrostowej tylko na krótki okres czasu. Pozwala to na monitorowanie różnic w de novo , a nie surowego stężenia.
Wykorzystano go również do badania tolerancji biofilmu na antybiotyki w celu rozróżnienia subpopulacji tolerujących i wrażliwych
NeuCode SILAC
Tradycyjnie poziom multipleksowania w SILAC był ograniczony ze względu na liczbę dostępnych izotopów SILAC. Niedawno nowa technika o nazwie NeuCode (kodowanie neutronów) SILAC zwiększyła poziom multipleksowania osiągalny dzięki znakowaniu metabolicznemu (do 4). Metoda aminokwasów NeuCode jest podobna do SILAC, ale różni się tym, że znakowanie wykorzystuje tylko ciężkie aminokwasy. Użycie tylko ciężkich aminokwasów eliminuje potrzebę 100% włączenia aminokwasów potrzebnych do SILAC. Zwiększona zdolność multipleksowania aminokwasów NeuCode wynika z wykorzystania defektów masy z dodatkowych neutronów w stabilnych izotopach. Te niewielkie różnice mas muszą jednak zostać rozwiązane na spektrometrach mas o wysokiej rozdzielczości.
Dalsza lektura
- Ong SE, Kratchmarova I, Mann M (2003). „Właściwości argininy podstawionej 13C w stabilnym znakowaniu izotopowym przez aminokwasy w hodowli komórkowej (SILAC)”. Dziennik badań proteomu . 2 (2): 173–181. doi : 10.1021/pr0255708 . PMID 12716131 .
- Ong SE, Mann M (2006). „Praktyczny przepis na stabilne znakowanie izotopów przez aminokwasy w hodowli komórkowej (SILAC)”. Protokoły natury . 1 (6): 2650–2660. doi : 10.1038/nprot.2006.427 . PMID 17406521 . S2CID 10651610 .
- Ong SE, Mann M (2007). „Stabilne znakowanie izotopów przez aminokwasy w hodowli komórkowej do ilościowej proteomiki”. Ilościowa proteomika za pomocą spektrometrii mas . Metody w biologii molekularnej . Tom. 359. s. 37–52. doi : 10.1007/978-1-59745-255-7_3 . ISBN 978-1-58829-571-2 . PMID 17484109 .