Kwantyfikacja bez etykiet
Oznaczanie ilościowe bez znaczników to metoda stosowana w spektrometrii mas , której celem jest określenie względnej ilości białek w dwóch lub więcej próbkach biologicznych . W przeciwieństwie do innych metod oznaczania ilościowego białek , oznaczanie ilościowe bez znaczników nie wykorzystuje stabilnego związku zawierającego izotop do chemicznego wiązania się z białkiem, a tym samym znakowania.
Realizacja
Kwantyfikacja bez znaczników może opierać się na intensywności sygnału prekursora lub na zliczaniu widmowym . Pierwsza metoda jest przydatna w przypadku zastosowania do widm masowych o wysokiej precyzji, takich jak te uzyskane przy użyciu nowej generacji analizatorów czasu przelotu (ToF), jonowego rezonansu cyklotronowego z transformacją Fouriera (FTICR) lub analizatorów masy Orbitrap . Moc wysokiej rozdzielczości ułatwia ekstrakcję sygnałów peptydowych na MS 1 i w ten sposób oddziela kwantyfikację od procesu identyfikacji. W przeciwieństwie do tego, zliczanie widmowe po prostu zlicza liczbę widm zidentyfikowanych dla danego peptydu w różnych próbkach biologicznych, a następnie integruje wyniki dla wszystkich zmierzonych peptydów białka (białek), które są oznaczane ilościowo.
Ramy obliczeniowe podejścia bez znaczników obejmują wykrywanie peptydów, dopasowywanie odpowiednich peptydów w wielu danych LC-MS, wybieranie peptydów rozróżniających.
Spektrometria ekspresji nienaruszonego białka (IPEx) to metoda oznaczania ilościowego bez znaczników w spektrometrii mas, opracowywana przez grupę chemii analitycznej w Amerykańskim Centrum Bezpieczeństwa Żywności i Żywienia Stosowanego ds. Żywności i Leków oraz w innych miejscach. Nienaruszone białka są analizowane za pomocą LCMS , zwykle kwadrupolowego pomiaru czasu przelotu w trybie profilu, a pełny profil białka jest określany i oznaczany ilościowo przy użyciu oprogramowania do redukcji danych. Wczesne wyniki są bardzo zachęcające. W jednym z badań dwie grupy powtórzeń leczenia z próbek ssaków (różne organizmy o podobnej historii leczenia, ale nie powtórzenia techniczne) pokazują dziesiątki biomarkerów białek o niskim CV, co sugeruje, że IPEx jest realną technologią do badania ekspresji białek.
Wykrywanie peptydów
Zazwyczaj sygnały peptydowe są wykrywane na poziomie MS1 i odróżniane od szumu chemicznego dzięki charakterystycznemu wzorowi izotopowemu. Te wzorce są następnie śledzone w wymiarze czasu retencji i wykorzystywane do rekonstrukcji chromatograficznego profilu elucji masy monoizotopowego peptydu. Całkowity prąd jonowy sygnału peptydowego jest następnie całkowany i używany jako ilościowy pomiar pierwotnego stężenia peptydu. Dla każdego wykrytego peptydu najpierw znajdują się wszystkie piki izotopowe, a następnie przypisuje się stan naładowania.
Kwantyfikacja bez znaczników może opierać się na intensywności sygnału prekursora i stwarza problemy z powodu interferencji izolacji: w badaniach o dużej przepustowości tożsamość mierzonego jonu prekursora peptydu może z łatwością być zupełnie innym peptydem o podobnym stosunku m/z i który eluuje w ramach czasowych pokrywających się z ramami czasowymi poprzedniego peptydu. Zliczanie spektralne jest problematyczne ze względu na fakt, że peptydy są identyfikowane, co powoduje konieczność przeprowadzenia dodatkowego skanu MS/MS, co zabiera czas, a tym samym zmniejsza rozdzielczość eksperymentu.
Dopasowanie odpowiednich peptydów
W przeciwieństwie do znakowania różnicowego, każda próbka biologiczna musi być mierzona oddzielnie w eksperymencie bez etykiet. Wyekstrahowane sygnały peptydowe są następnie mapowane w kilku lub wielu pomiarach LC-MS przy użyciu ich współrzędnych wymiarów masy do ładunku i czasu retencji. Dane z precyzyjnych instrumentów o dużej masie znacznie ułatwiają ten proces i zwiększają pewność dopasowania prawidłowych sygnałów peptydowych w seriach.
Oczywiste jest, że zróżnicowane przetwarzanie próbek biologicznych wymaga posiadania standardu, który można wykorzystać do dostosowania wyników. W tym celu można zastosować peptydy, od których nie oczekuje się zmiany poziomu ekspresji w różnych próbkach biologicznych. Jednak nie wszystkie peptydy dobrze jonizują i dlatego wybór kandydatów powinien być dokonany po wstępnym badaniu, które powinno charakteryzować jedynie zawartość białka w próbkach biologicznych, które będą badane.
Selekcja dyskryminujących peptydów
Wreszcie, stosowane są wyrafinowane metody normalizacji w celu usunięcia systematycznych artefaktów w wartościach intensywności peptydów między pomiarami LC-MS. Następnie, rozróżniające peptydy identyfikuje się przez wybranie peptydów, których znormalizowane intensywności są różne (np. wartość p < 0,05) wśród wielu grup próbek.
Ponadto nowsze hybrydowe spektrometry mas, takie jak LTQ OrbiTrap, oferują możliwość uzyskiwania identyfikacji peptydów MS/MS równolegle z precyzyjnym pomiarem masy peptydów na poziomie MS1. Rodzi to wyzwanie obliczeniowe dla przetwarzania i integracji tych dwóch źródeł informacji i doprowadziło do opracowania nowych, obiecujących strategii kwantyfikacji.