Znacznik masy tandemowej
Tandemowy znacznik masy ( TMT ) jest znacznikiem chemicznym, który ułatwia multipleksowanie próbek w spektrometrii mas (MS) do oznaczania ilościowego i identyfikacji makrocząsteczek biologicznych, takich jak białka , peptydy i kwasy nukleinowe . TMT należy do rodziny odczynników określanych jako znaczniki masy izobarycznej które są zbiorem cząsteczek o tej samej masie, ale po fragmentacji dają jony reporterowe o różnej masie. Względny stosunek zmierzonych jonów reporterowych reprezentuje względną obfitość znakowanej cząsteczki, chociaż supresja jonów ma szkodliwy wpływ na dokładność. Pomimo tych komplikacji wykazano, że proteomika oparta na TMT zapewnia większą precyzję niż oznaczanie ilościowe bez znaczników . Oprócz wspomagania ilościowego oznaczania białek, znaczniki TMT mogą również zwiększać czułość wykrywania niektórych wysoce hydrofilowych analitów, takich jak fosfopeptydy, w analizach RPLC -MS.
Wersje
Obecnie dostępnych jest sześć odmian TMT: TMTzero, nieizotopowo podstawiona struktura rdzenia; TMTduplex, izobaryczna para znaczników masowych z pojedynczym podstawieniem izotopowym; TMTsixplex, izobaryczny zestaw sześciu znaczników masowych z pięcioma podstawieniami izotopowymi; [ potrzebne dodatkowe źródło ] TMT 10-plex – zestaw 10 znaczników masy izotopowej, które wykorzystują region reporterowy TMTsixplex, ale wykorzystują inny izotop elementarny, aby wytworzyć różnicę masy 0,0063 Da, [potrzebne dodatkowe źródło ] TMTpro wersja 16 plex z innym reporterem i normalizatorem masy niż oryginalny TMT i TMTpro Zero.
| Zmiana masowa | |
|---|---|
| TMT 0 | 224.152478 |
| TMT 2 | 225.155833 |
| TMT 6/10 | 229.162932 |
| TMT 11 | 229.169252 |
| TMT Pro zero | 295.18959 |
| TMT Pro | 304.2071 |
Znaczniki zawierają cztery regiony, a mianowicie region reporterowy masy (M), region łącznika rozszczepialnego (F), region normalizacji masy (N) i grupę reaktywną białka (R). Struktury chemiczne wszystkich znaczników są identyczne, ale każdy zawiera izotopy podstawione w różnych pozycjach, tak że regiony reportera masy i normalizacji masy mają różne masy cząsteczkowe w każdym znaczniku. Połączone regiony MFNR znaczników mają takie same całkowite masy cząsteczkowe i strukturę, dzięki czemu podczas chromatografii lub elektroforezy separacji iw trybie pojedynczego MS cząsteczki oznaczone różnymi znacznikami są nie do odróżnienia. Po fragmentacji w MS/MS , informacje o sekwencji uzyskuje się z fragmentacji szkieletu peptydowego , a jednocześnie uzyskuje się dane ilościowe z fragmentacji znaczników, co prowadzi do masowych jonów reporterowych.
Kwantyfikacja znakowanych peptydów
Struktury znaczników TMT są publicznie dostępne za pośrednictwem bazy danych unimod na unimod.org, a zatem oprogramowanie do spektrometrii mas , takie jak Mascot , jest w stanie uwzględnić masy znaczników. Dodatkowo od wersji 2.2 Mascot ma możliwość oznaczania ilościowego za pomocą TMT i innych znaczników masy izobarycznej bez użycia dodatkowego oprogramowania. Intuicyjnie zaufanie związane z pomiarem białka zależy od podobieństwa proporcji z różnych peptydów i poziomu sygnału tych pomiarów. Pojawiło się matematycznie rygorystyczne podejście o nazwie BACIQ, które integruje intensywności peptydów i zgodność pomiarów peptydów z przedziałami ufności dla stosunków białek. Standard TKO może być wykorzystany do oceny zakłóceń [ wymagane źródło inne niż podstawowe ]
Koncepcja przewoźnika izobarycznego
Znaczniki TMT są powszechnie używane do oznaczania próbek o równej liczebności. Jeśli jednak jedna ze znakowanych próbek występuje w większej liczbie, może to zwiększyć czułość analizy dla wszystkich próbek. Takie izobarycznie znakowane próbki są określane jako nośniki izobaryczne. Zostały wprowadzone do analizy białek jednokomórkowych za pomocą spektrometrii mas i znalazły wiele innych zastosowań.