Terapia genowa padaczki
Badana jest terapia genowa dla niektórych postaci padaczki . Opiera się na wirusowych lub niewirusowych w celu dostarczenia DNA lub RNA do docelowych obszarów mózgu, w których pojawiają się napady, w celu zapobiegania rozwojowi padaczki lub zmniejszenia częstotliwości i/lub nasilenia napadów . Terapia genowa przyniosła obiecujące wyniki we wczesnych stadiach badań klinicznych innych zaburzeń neurologicznych , takich jak choroba Parkinsona , budząc nadzieję, że stanie się metodą leczenia nieuleczalnej padaczki .
Przegląd
Padaczka odnosi się do grupy przewlekłych zaburzeń neurologicznych charakteryzujących się napadami padaczkowymi , dotykającymi ponad 50 milionów ludzi, czyli 0,4–1% światowej populacji. Istnieje podstawowa wiedza na temat patofizjologii padaczki, zwłaszcza postaci charakteryzujących się początkiem napadów z określonego obszaru mózgu ( padaczka częściowa ). Chociaż większość pacjentów reaguje na leki, około 20–30% nie poprawia się po zastosowaniu leków przeciwpadaczkowych lub ich nie toleruje . W przypadku takich pacjentów operację usunięcia strefy epileptogennej można zaproponować niewielkiej mniejszości, ale nie jest to wykonalne, jeśli napady pochodzą z obszarów mózgu, które są niezbędne dla języka, wzroku, ruchu lub innych funkcji. W rezultacie wiele osób z padaczką pozostaje bez możliwości rozważenia możliwości leczenia, a zatem istnieje silna potrzeba opracowania innowacyjnych metod leczenia padaczki. [ potrzebne źródło ]
Dzięki zastosowaniu transferu genów wektora wirusowego, w celu dostarczenia DNA lub RNA do strefy epileptogennej, kilka neuropeptydów , kanałów jonowych i receptorów neuroprzekaźników wykazało potencjał jako transgeny do leczenia padaczki. Wśród wektorów są adenowirusowe i wirusy towarzyszące adenowirusom (AAV), które charakteryzują się wysoką i wydajną transdukcją, łatwością produkcji w dużych ilościach, szerokim zakresem gospodarzy i rozszerzoną ekspresją genów. Wektory lentiwirusowe również okazały się obiecujące.
Badania kliniczne
Wśród wyzwań związanych z translacją kliniczną terapii genowej są możliwe odpowiedzi immunologiczne na wektory wirusowe i transgeny oraz możliwość mutagenezy insercyjnej , która może być szkodliwa dla bezpieczeństwa pacjentów. Skalowanie od objętości potrzebnej do badań na zwierzętach do ilości potrzebnej do skutecznej transfekcji u ludzi jest obszarem trudności, chociaż udało się go pokonać w przypadku innych chorób. Dzięki rozmiarowi mniejszemu niż 20 nm, AAV częściowo rozwiązuje te problemy, umożliwiając jego przejście przez przestrzeń zewnątrzkomórkową, co prowadzi do powszechnej transfekcji. Chociaż lentiwektory mogą integrować się z genomem żywiciela, może to nie stanowić zagrożenia w leczeniu chorób neurologicznych, ponieważ dorosłe neurony nie dzielą się, a zatem są mniej podatne na mutagenezę insercyjną [ potrzebne źródło ]
Podejścia wirusowe w rozwoju przedklinicznym
W poszukiwaniu metody leczenia padaczki bierze się pod uwagę patofizjologię padaczki. Ponieważ napady padaczkowe są zwykle wynikiem nadmiernych i synchronicznych wyładowań neuronów pobudzających, logicznym celem terapii genowej jest zmniejszenie pobudzenia lub wzmocnienie hamowania. Spośród podejść wirusowych badane transgeny neuropeptydów to somatostatyna, galanina i neuropeptyd Y (NPY). Jednak adenozyna i kwas gamma-aminomasłowy (GABA) oraz receptory GABA również nabierają większego rozpędu. Inne badane transgeny to kanały potasowe i narzędzia do tłumienia pobudliwości na żądanie ( optogenetyka i chemogenetyka ). [ potrzebne źródło ]
Adenozyna
Adenozyna jest hamującym nukleozydem, który podwaja się jako neuromodulator , wspomagając modulację funkcji mózgu. Ma właściwości przeciwzapalne, oprócz właściwości neuroprotekcyjnych i przeciwpadaczkowych. Najbardziej rozpowszechnioną teorią jest to, że po uszkodzeniu mózgu następuje zwiększona ekspresja kinazy adenozynowej (ADK). Wzrost kinazy adenozynowej powoduje zwiększenie tempa metabolizmu nukleozydów adenozynowych. Ze względu na spadek tych nukleozydów, które mają właściwości przeciwpadaczkowe i nadekspresję ADK, wyzwalane są drgawki, co może prowadzić do rozwoju epileptogenezy . Badania wykazały, że nadekspresja ADK wynika z astrogliozy po urazie mózgu, co może prowadzić do rozwoju epileptogenezy. Podczas gdy nadekspresja ADK prowadzi do zwiększonej podatności na napady padaczkowe, efektom można przeciwdziałać i łagodzić je za pomocą adenozyny. W oparciu o właściwości zapewniane przez adenozynę w zapobieganiu napadom, oprócz zatwierdzenia przez FDA w leczeniu innych dolegliwości, takich jak tachykardia i przewlekły ból, adenozyna jest idealnym celem dla rozwoju genowych terapii przeciwpadaczkowych.
Galanina
Galanina , występująca głównie w ośrodkowym układzie nerwowym (układ limbiczny, kora gruszkowata i ciało migdałowate), odgrywa rolę w zmniejszaniu długotrwałego wzmocnienia (LTP), regulowaniu nawyków konsumpcyjnych, a także hamowaniu aktywności napadów padaczkowych. Wykazano, że galanina, wprowadzona w latach 90. przez Mazarati i wsp., ma neuroprotekcyjne i hamujące. Wykorzystując myszy z niedoborem receptorów GalR1, model wywołany pikrotoksyną, aby wykazać, że galanina odgrywa rolę w modulowaniu i zapobieganiu utracie komórek wnęki, a także skracaniu czasu trwania indukowanych napadów. Przeprowadzone badania potwierdzają te ustalenia dotyczące zapobiegania utracie komórek rzęsatych wnęki, zmniejszania liczby i czasu trwania napadów indukowanych, zwiększania progu stymulacji wymaganego do wywołania napadów oraz hamowania uwalniania glutaminianu, który zwiększałby podatność na aktywność napadową. Ekspresję galaniny można wykorzystać do znacznego złagodzenia i zmniejszenia aktywności napadów padaczkowych oraz ograniczenia śmierci komórek napadowych.
neuropeptyd Y
Neuropeptyd Y (NPY), który znajduje się w autonomicznym układzie nerwowym , pomaga modulować podwzgórze, a tym samym nawyki żywieniowe. Przeprowadzono eksperymenty w celu określenia wpływu NPY na modele zwierzęce przed i po indukowanych napadach. Aby ocenić efekt przed napadami padaczkowymi, w jednym badaniu wstawiono wektory 8 tygodni przed rozpaleniem , co wykazało wzrost progu drgawkowego. W celu oceny efektów po epileptogenezy , wektory wstrzykiwano do hipokampa szczurów po wywołaniu napadów. Spowodowało to zmniejszenie aktywności napadów. Badania te wykazały, że NPY zwiększa próg drgawkowy u szczurów, zatrzymuje postęp choroby i skraca czas trwania napadu padaczkowego. Po zbadaniu wpływu NPY na reakcje behawioralne i fizjologiczne odkryto, że nie ma on wpływu na LTP, uczenie się ani pamięć. Protokół transferu genu NPY jest weryfikowany przez FDA.
Somatostatyna
Somatostatyna jest neuropeptydem i neuromodulatorem , który odgrywa rolę w regulacji hormonów, a także wspomaga sen i aktywność ruchową. Występuje głównie w interneuronach, które modulują szybkość wypalania komórek piramidalnych głównie na poziomie lokalnym. Działają one hamująco na komórki piramidalne. W serii badań, w których somatostatyna była wyrażana w modelu rozpalania gryzoni , stwierdzono, że somatostatyna skutkowała skróceniem średniego czasu trwania napadów padaczkowych, zwiększając jej potencjał jako leku przeciwdrgawkowego. Teoria wykorzystania somatostatyny jest taka, że jeśli komórki piramidalne zostaną wyeliminowane, utracone zostanie sprzężenie zwrotne, inaczej znane jako hamowanie. Interneurony zawierające somatostatynę przenoszą neuroprzekaźnik GABA, który przede wszystkim powoduje hiperpolaryzację komórek, z czego wywodzi się teoria sprzężenia zwrotnego. Nadzieją terapii genowej jest to, że poprzez nadekspresję somatostatyny w określonych komórkach i zwiększenie napięcia GABA-ergicznego możliwe jest przywrócenie równowagi między hamowaniem a pobudzeniem.
Kanały potasowe
Kv1.1 to bramkowany napięciem kanał potasowy kodowany przez gen KCNA1 . Jest szeroko eksprymowany w mózgu i nerwach obwodowych i odgrywa rolę w kontrolowaniu pobudliwości neuronów i ilości neuroprzekaźnika uwalnianego z zakończeń aksonów. Udaną terapię genową przy użyciu lentiwirusowego dostarczania KCNA1 odnotowano w modelu gryzoni ogniskowej padaczki kory ruchowej . Leczenie było dobrze tolerowane, bez wykrywalnego wpływu na koordynację czuciowo-ruchową. , że terapia genowa ze zmodyfikowanym kanałem potasowym dostarczana za pomocą nieintegrującego lentiwektora , który pozwala uniknąć ryzyka mutagenezy insercyjnej , lub AAV jest skuteczna w innych modelach padaczki.
Optogenetyka
Potencjalną przeszkodą w klinicznej translacji terapii genowej jest to, że manipulacja genetycznym składem neuronów za pośrednictwem wektora wirusowego jest nieodwracalna. Alternatywnym podejściem jest użycie narzędzi do tłumienia na żądanie pobudliwości neuronów i obwodów. Pierwszym takim podejściem było wykorzystanie optogenetyki . Kilka laboratoriów wykazało, że hamujące światłoczułe białko halorodopsyna może tłumić wyładowania podobne do napadów in vitro, jak również aktywność epileptyczną in vivo. Wadą optogenetyki jest to, że światło musi być dostarczane do obszaru mózgu wyrażającego opsynę . Można to osiągnąć za pomocą światłowodów sprzężonych z laserem lub diod elektroluminescencyjnych, ale są one inwazyjne. [ potrzebne źródło ]
Chemogenetyka
Alternatywnym podejściem do kontroli pobudliwości obwodu na żądanie, które nie wymaga dostarczania światła do mózgu, jest zastosowanie chemogenetyki . Polega to na ekspresji zmutowanego receptora w ognisku napadu, który nie reaguje na endogenne neuroprzekaźniki , ale może być aktywowany przez egzogenny lek. Receptory sprzężone z białkiem G zmutowane w ten sposób nazywane są projektowanymi receptorami aktywowanymi wyłącznie przez designerskie leki (DREADD) . Donoszono o sukcesie w leczeniu padaczki przy użyciu hamującego DREADD hM4D(Gi), który pochodzi z muskarynowego M4 . Sama ekspresja hM4D(Gi) za pośrednictwem AAV w modelu padaczki ogniskowej na gryzoniach nie miała wpływu, ale aktywowana przez N-tlenek klozapiny tłumiła napady. Leczenie nie miało wykrywalnych skutków ubocznych i zasadniczo nadaje się do tłumaczenia klinicznego . Olanzapina została zidentyfikowana jako pełny i silny aktywator hM4D(Gi). Wariant chemogenetyki „zamkniętej pętli” mający na celu powstrzymanie napadów padaczkowych, który pozwala uniknąć konieczności stosowania egzogennego ligandu, opiera się na kanale chlorkowym bramkowanym glutaminianem, który hamuje neurony, ilekroć wzrasta zewnątrzkomórkowe stężenie pobudzającego neuroprzekaźnika glutaminianu .
CRISPR
Mysi model zespołu Dravet był leczony przy użyciu wariantu CRISPR , który opiera się na przewodnim RNA i martwym białku Cas9 ( dCas9 ) w celu rekrutacji aktywatorów transkrypcji do regionu promotora genu kanału sodowego Scn1a w interneuronach .
Podejścia niewirusowe
Magnetofekcja odbywa się za pomocą superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza pokrytych polietylenoiminą . Nanocząsteczki tlenku żelaza są idealne do zastosowań biomedycznych w organizmie ze względu na ich biodegradowalny, kationowy, nietoksyczny i zatwierdzony przez FDA charakter. W warunkach transferu genów interesujące receptory są pokryte nanocząstkami. Receptory następnie dopasowują się i podróżują do celu będącego przedmiotem zainteresowania. Gdy cząsteczka zadokuje, DNA jest dostarczane do komórki poprzez pinocytozę lub endocytozę . Po dostarczeniu temperatura zostaje nieznacznie podwyższona, powodując lizę nanocząsteczek tlenku żelaza i uwolnienie DNA. Ogólnie rzecz biorąc, technika ta jest przydatna do zwalczania powolnej akumulacji wektorów i niskiego stężenia wektorów w obszarach docelowych. Technikę można również dostosować do właściwości fizycznych i biochemicznych receptorów, modyfikując właściwości nanocząstek tlenku żelaza.
Implikacje na przyszłość
Zastosowanie terapii genowej w leczeniu zaburzeń neurologicznych, takich jak padaczka, stało się coraz bardziej opłacalnym obszarem trwających badań, a głównymi celami są somatostatyna , galanina , neuropeptyd y , kanały potasowe , optogenetyka i chemogenetyka padaczki. Ponieważ dziedzina terapii genowej wciąż się rozwija i wykazuje obiecujące wyniki w leczeniu padaczki, wśród innych chorób, należy przeprowadzić dodatkowe badania w celu zapewnienia bezpieczeństwa pacjentów, opracowania alternatywnych metod dostarczania DNA i znalezienia wykonalnych metod zwiększania objętości dostarczania.