Test przesunięcia termicznego
Test przesunięcia termicznego ( TSA ) mierzy zmiany temperatury denaturacji termicznej , a tym samym stabilność białka w różnych warunkach, takich jak zmiany stężenia leku, pH buforu lub siły jonowej , potencjał redoks lub mutacja sekwencji . Najbardziej powszechną metodą pomiaru przesunięć termicznych białek jest różnicowa fluorymetria skaningowa ( DSF ) lub termofluor , która wykorzystuje specjalistyczne barwniki fluorogeniczne.
Wiązanie ligandów o niskiej masie cząsteczkowej może zwiększyć stabilność termiczną białka, jak opisali Daniel Koshland (1958) oraz Kaj Ulrik Linderstrøm-Lang i Schellman (1959). Prawie połowa enzymów wymaga kofaktora jonu metalu . Białka termostabilne są często bardziej przydatne niż ich nietermostabilne odpowiedniki, np. polimeraza DNA w reakcji łańcuchowej polimerazy, więc inżynieria białek często obejmuje dodawanie mutacji w celu zwiększenia stabilności termicznej. Krystalizacja białek jest bardziej skuteczna w przypadku białek o wyższej temperaturze topnienia, a dodanie składników buforujących, które stabilizują białka, zwiększa prawdopodobieństwo tworzenia się kryształów białek. Badając pH, należy wziąć pod uwagę możliwy wpływ cząsteczki buforu na stabilność termiczną, a także fakt, że pKa każdej cząsteczki buforu zmienia się jednoznacznie wraz z temperaturą. Dodatkowo, za każdym razem, gdy badany jest gatunek naładowany, należy uwzględnić skutki działania przeciwjonu .
Stabilność termiczną białek tradycyjnie badano za pomocą testów biochemicznych , dichroizmu kołowego lub skaningowej kalorymetrii różnicowej . Testy biochemiczne wymagają aktywności katalitycznej danego białka, jak również specyficznego testu. Dichroizm kołowy i skaningowa kalorymetria różnicowa zużywają duże ilości białka i są metodami o niskiej przepustowości. Test termofluorowy był pierwszym wysokowydajnym testem przesunięcia termicznego, a jego użyteczność i ograniczenia pobudziły wynalezienie wielu alternatywnych metod. Każda metoda ma swoje mocne i słabe strony, ale wszystkie zmagają się z wewnętrznie nieuporządkowanymi białkami bez wyraźnie określonej struktury trzeciorzędowej ponieważ istotą testu przesunięcia termicznego jest pomiar temperatury, w której białko przechodzi od dobrze określonej struktury do nieporządku.
Metody
DSF-GTP
Technika DSF-GTP została opracowana przez zespół kierowany przez Patricka Schaeffera z James Cook University i opublikowana w Moreau et al. 2012. Rozwój różnicowej fluorymetrii skaningowej i możliwości termofluoru o wysokiej przepustowości znacznie ułatwiły badania przesiewowe warunków krystalizacji białek i dużych bibliotek mutantów w programach genomiki strukturalnej, a także ligandów w programach odkrywania leków i genomiki funkcjonalnej. Techniki te są ograniczone ze względu na ich wymagania dotyczące zarówno wysoko oczyszczonych białek, jak i solwatochromowych barwników, co powoduje potrzebę bardziej niezawodnych technologii o wysokiej przepustowości, które można stosować z próbkami surowego białka. Potrzeba ta została zaspokojona poprzez opracowanie nowej, wysokowydajnej technologii do ilościowego oznaczania stabilności białek i wiązania ligandów metodą skaningowej fluorymetrii różnicowej białek znakowanych białkiem zielonej fluorescencji (GFP). Technologia ta opiera się na zasadzie, że zmiana w proksymalnym środowisku GFP, taka jak rozwijanie i agregacja białka będącego przedmiotem zainteresowania, jest mierzalna poprzez jej wpływ na fluorescencję fluoroforu. Technologia jest prosta, szybka i niewrażliwa na zmiany objętości próbek, a użyteczny zakres temperatury i pH wynosi odpowiednio 30–80°C i 5–11. System nie wymaga stosowania barwników solwatochromowych, co zmniejsza ryzyko interferencji. Próbki białek są po prostu mieszane z warunkami testowymi w 96-dołkowej płytce i poddawane protokołowi krzywej topnienia przy użyciu termocyklera działającego w czasie rzeczywistym. Dane są uzyskiwane w ciągu 1–2 godzin i obejmują unikalne środki kontroli jakości za pośrednictwem sygnału GFP. DSF-GTP został zastosowany do charakteryzacji białek i badań przesiewowych małych związków.
termofluor
Technika ta została po raz pierwszy opisana przez Semisotnova i in. (1991) przy użyciu 1,8-ANS i kuwet kwarcowych. Firma 3 Dimensional Pharmaceuticals jako pierwsza opisała wersję o wysokiej przepustowości przy użyciu czytnika płytek, a firma Wyeth Research opublikowała odmianę metody z SYPRO Orange zamiast 1,8-ANS. SYPRO Orange ma profil długości fali wzbudzenia/emisji zgodny z qPCR maszyny, które są niemal wszechobecne w instytucjach prowadzących badania z zakresu biologii molekularnej. Nazwa różnicowa fluorymetria skaningowa (DSF) została wprowadzona później, ale preferowany jest termofluor, ponieważ thermofluor nie jest już znakiem towarowym, a skaningowa fluorymetria różnicowa jest łatwo mylona z różnicową kalorymetrią skaningową.
SYPRO Orange wiąże się niespecyficznie z powierzchniami hydrofobowymi, a woda silnie gasi jego fluorescencję. Kiedy białko się rozwija, odsłonięte powierzchnie hydrofobowe wiążą barwnik, co powoduje wzrost fluorescencji poprzez wykluczenie wody. Detergentowe micele będą również wiązać barwnik i dramatycznie zwiększać hałas w tle. Efekt ten zmniejsza się po przejściu na barwnik ANS; jednak ten odczynnik wymaga wzbudzenia UV. Krzywa stabilności i jej wartość w punkcie środkowym (temperatura topnienia, T m znana również jako temperatura ekspozycji hydrofobowej, T h ) uzyskuje się poprzez stopniowe zwiększanie temperatury w celu rozwinięcia białka i pomiar fluorescencji w każdym punkcie. Krzywe są mierzone tylko dla białka i białka + ligandu oraz ΔTm jest wyliczone. Metoda może nie działać zbyt dobrze w przypadku interakcji białko-białko, jeśli jeden z partnerów interakcji zawiera duże obszary hydrofobowe, ponieważ trudno jest przeanalizować zapobieganie agregacji, stabilizację natywnych fałd i przeszkodę steryczną w dostępie barwnika do miejsc hydrofobowych. Ponadto częściowo zagregowane białko może również ograniczać względny wzrost fluorescencji po podgrzaniu; w skrajnych przypadkach nie będzie żadnego wzrostu fluorescencji, ponieważ całe białko jest już w agregatach przed ogrzewaniem. Znajomość tego efektu może być bardzo przydatna, ponieważ wysoki względny wzrost fluorescencji sugeruje znaczną frakcję sfałdowanego białka w materiale wyjściowym.
Test ten umożliwia wysokowydajne badania przesiewowe ligandów do docelowego białka i jest szeroko stosowany na wczesnych etapach odkrywania leków w przemyśle farmaceutycznym, w pracach nad genomiką strukturalną i wysokoprzepustową inżynierią białek.
Typowy test
- Materiały: Fluorometr wyposażony w kontrolę temperatury lub podobne oprzyrządowanie (maszyny qPCR); odpowiedni barwnik fluorescencyjny; odpowiednią płytkę testową, taką jak 96-dołkowa qPCR .
- Roztwory związków: ligandy testowe przygotowuje się w stężeniu 50- do 100-krotnie, zazwyczaj w zakresie 10-100 mM. Do miareczkowania typowy protokół eksperymentalny wykorzystuje zestaw 12 studzienek, zawierających 11 różnych stężeń badanego związku z pojedynczą studzienką kontroli negatywnej.
- Roztwór białka: Zazwyczaj białko docelowe jest rozcieńczane ze stężonego roztworu wyjściowego do stężenia roboczego ~0,5–5 μM białka z barwnikiem w odpowiednim buforze testowym. Dokładne stężenia białka i barwnika są określane na podstawie eksperymentalnych badań rozwojowych.
- Wirowanie i dozowanie oleju: Krótkie wirowanie (~1000 × g, 1 min) płytki testowej w celu wymieszania związków z roztworem białka, na roztwór nakłada się 1–2 μl oleju silikonowego , aby zapobiec parowaniu podczas ogrzewania (niektóre systemy wykorzystują zamiast plastikowych uszczelek), po którym następuje dodatkowy etap wirowania (~1000 x g, 1 min).
- Konfiguracja oprzyrządowania: Typowe szybkości narastania temperatury mieszczą się w zakresie od 0,1 do 10°C/min, ale generalnie w zakresie 1°C/min. Fluorescencja w każdym dołku jest mierzona w regularnych odstępach czasu, 0,2–1°C/obraz, w zakresie temperatur obejmującym typowe temperatury rozwijania białek wynoszące 25–95°C.
CPM, barwniki specyficzne dla tiolu
Aleksandrow i in. (2008) opublikowali odmianę testu termofluorowego, w którym SYPRO Orange został zastąpiony N- [4-(7-dietyloamino-4-metylo-3-kumarynylo)fenylo]maleimidem (CPM), związkiem, który fluoryzuje dopiero po reakcji z nukleofil. CPM ma wysokie preferencje dla tioli w stosunku do innych typowych biologicznych nukleofili i dlatego będzie reagować z cysteiną łańcuchy boczne przed innymi. Cysteiny są zazwyczaj zakopane we wnętrzu zwiniętego białka, ponieważ są hydrofobowe. Kiedy białko denaturuje, tiole cysteiny stają się dostępne i można odczytać sygnał fluorescencyjny z przereagowanego CPM. Długość fali wzbudzenia i emisji dla przereagowanego CPM wynosi 387 nm/463 nm, dlatego wymagany jest fluorescencyjny czytnik płytek lub maszyna qPCR ze specjalistycznymi filtrami. Aleksandrow i in. zastosowali tę technikę z powodzeniem na białkach błonowych Apelin GPCR i FAAH , a także β-laktoglobinie, która fibryluje podczas ogrzewania, zamiast przechodzić do stopionej globulki.
DCVJ, barwniki wrażliwe na sztywność
4-(dicyjanowinylo)julolidyna (DCVJ) to molekularna sonda typu rotor z fluorescencją silnie zależną od sztywności otoczenia. Kiedy białko ulega denaturacji, DCVJ zwiększa fluorescencję. Donoszono, że działa z 40 mg/ml przeciwciała.
Wewnętrzny czas życia fluorescencji tryptofanu
Czas życia fluorescencji tryptofanu jest różny dla sfałdowanego i niezwiniętego białka. Kwantyfikacja czasu życia fluorescencji wzbudzonej promieniowaniem UV w różnych przedziałach temperatur daje pomiar Tm . Istotną zaletą tej techniki jest brak konieczności dodawania barwników reporterowych, ponieważ tryptofan jest nieodłączną częścią białka. Może to być również wadą, ponieważ nie wszystkie białka zawierają tryptofan. Wewnętrzny czas życia fluorescencji działa z białkami błonowymi i micelami detergentowymi, ale silna fluorescencja UV w buforze może zagłuszyć sygnał i niewiele artykułów jest publikowanych przy użyciu techniki testów przesunięcia termicznego.
Długość fali wewnętrznej fluorescencji tryptofanu
Długości fal wzbudzenia i emisji tryptofanu zależą od bezpośredniego otoczenia i dlatego różnią się między sfałdowanymi i nierozłożonymi białkami, podobnie jak czas życia fluorescencji. Obecnie na rynku dostępne są co najmniej dwie maszyny, które mogą odczytywać to przesunięcie długości fali w sposób wysokoprzepustowy podczas ogrzewania próbek. Zalety i wady są takie same jak w przypadku czasu życia fluorescencji, z wyjątkiem tego, że w literaturze naukowej znajduje się więcej przykładów zastosowania. [ potrzebne źródło ]
Statyczne rozpraszanie światła
Statyczne rozpraszanie światła umożliwia monitorowanie rozmiarów gatunków w roztworze. Ponieważ białka zazwyczaj agregują po denaturacji (lub tworzą fibryle), wielkość wykrytych gatunków wzrośnie.
Jest to wolne od znaczników i niezależne od określonych reszt w kompozycji białka lub buforu. Jedynym wymaganiem jest to, aby białko faktycznie agregowało/fibrylowało po denaturacji i aby białko będące przedmiotem zainteresowania zostało oczyszczone.
FastPP
W szybkiej proteolizie równoległej badacz dodaje termostabilną proteazę ( termolizynę ) i równolegle pobiera próbki po podgrzaniu w termocyklerze gradientowym. Opcjonalnie, na przykład dla białek eksprymowanych na niskim poziomie, Western blot w celu określenia, w jakiej temperaturze białko ulega degradacji. W przypadku białek czystych lub wysoko wzbogaconych możliwa jest bezpośrednia detekcja SDS-PAGE, ułatwiająca bezpośrednią ocenę ilościową opartą na fluorescencji Commassie. FastPP wykorzystuje to, że białka stają się coraz bardziej podatne na proteolizę po rozłożeniu i że termolizyna rozszczepia reszty hydrofobowe, które zwykle znajdują się w rdzeniu białek.
Aby zmniejszyć obciążenie pracą, Western blot można zastąpić barwieniem znacznikiem polihistydynowym w żelu SDS-PAGE , pod warunkiem, że białko ma taki znacznik i jest wyrażane w odpowiednich ilościach.
FastPP można stosować na nieoczyszczonych, złożonych mieszaninach białek i białkach połączonych z innymi białkami, takimi jak GST lub GFP , o ile sekwencja będąca celem analizy Western blot, np. His-tag , jest bezpośrednio połączona z białkiem zainteresowań. Jednak dostępna w handlu termolizyna jest zależna od jonów wapnia i ulega denaturacji tuż powyżej 85 stopni Celsjusza. Tak więc w buforze musi być obecny wapń, a chelatory wapnia nieobecne w buforze - inne związki zakłócające działanie proteazy (takie jak wysokie stężenia detergentów) również mogą być problematyczne.
FASTpp był również używany do monitorowania fałdowania sprzężonego z wiązaniem wewnętrznie nieuporządkowanych białek (IDP).
CETSA
Komórkowy test przesunięcia termicznego (CETSA ® ) jest techniką biofizyczną stosowaną zarówno do żywych komórek, jak i do biopsji tkanek. CETSA ® opiera się na odkryciu, że krzywe topnienia białek mogą być również generowane w nienaruszonych komórkach i że wiązanie leku prowadzi do bardzo znaczącej stabilizacji termicznej białek. Po denaturacji białka ulegają agregacji i mogą być usunięte przez wirowanie po lizie komórek. Można wykryć stabilne białka znajdujące się w supernatancie; np. metodą western blot, alfa-LISA lub spektrometrią mas. CETSA® _ -technika jest bardzo rygorystyczna, powtarzalna i nie jest podatna na fałszywe alarmy. [ potrzebne źródło ] Jednak próbka lub związek małocząsteczkowy może wiązać się z białkiem w określonej ścieżce docelowej. Jeśli to białko indukuje dalszą stabilizację pierwotnego białka docelowego poprzez zdarzenie kaskadowe, może to objawiać się jako bezpośrednie zaangażowanie celu. Zaletą tej metody jest to, że jest wolna od znaczników, a zatem ma zastosowanie do badań wiązania leku w wielu różnych komórkach i tkankach. CETSA® _ można również przeprowadzić na lizatach komórkowych w porównaniu z nienaruszonymi komórkami, pomagając określić penetrację próbki przez błonę komórkową. [ potrzebne źródło ]
ThermoFAD
Wariant Thermofluor specyficzny dla białek wiążących flawinę. Analogicznie do testów wiązania termofluorowego, niewielką objętość roztworu białka ogrzewa się i obserwuje się wzrost fluorescencji w funkcji temperatury. W przeciwieństwie do termofluoru nie jest potrzebny żaden zewnętrzny barwnik fluorescencyjny, ponieważ kofaktor flawiny jest już obecny w białku wiążącym flawinę, a jego właściwości fluorescencyjne zmieniają się po rozwinięciu.
SEC-TS
Chromatografię wykluczania wielkości można zastosować bezpośrednio w celu uzyskania dostępu do stabilności białka w obecności lub nieobecności ligandów. Próbki oczyszczonego białka są podgrzewane w łaźni wodnej lub termocyklerze , schładzane, odwirowywane w celu usunięcia zagregowanych białek i analizowane na analitycznej HPLC . Gdy temperatura topnienia zostaje osiągnięta i białko wytrąca się lub agreguje, wysokość piku maleje, a wysokość piku pustego wzrasta. Można to wykorzystać do identyfikacji ligandów i inhibitorów oraz optymalizacji warunków oczyszczania.
Chociaż ma mniejszą przepustowość niż FSEC-TS, wymagając dużych ilości oczyszczonego białka, SEC-TS pozwala uniknąć jakiegokolwiek wpływu znacznika fluorescencyjnego na pozorną stabilność białka.
FSEC-TS
chromatografii wykluczania z detekcją fluorescencji białko będące przedmiotem zainteresowania jest znakowane fluorescencyjnie (np. GFP ) i przepuszczane przez żelową kolumnę filtracyjną w systemie FPLC wyposażonym w detektor fluorescencyjny. Otrzymany chromatogram pozwala badaczowi oszacować dyspersję i poziom ekspresji znakowanego białka w bieżącym buforze. Ponieważ mierzona jest tylko fluorescencja, na chromatogramie widać tylko znakowane białko. FSEC jest zwykle używany do porównywania ortologów białek błonowych lub detergentów przesiewowych w celu rozpuszczenia określonych białek błonowych.
W przypadku testu termostabilności opartego na chromatografii wykluczania z detekcją fluorescencji (FSEC-TS) próbki są podgrzewane w taki sam sposób jak w FastPP i CETSA, a po odwirowaniu w celu usunięcia osadu supernatant jest traktowany w taki sam sposób jak FSEC. Większe agregaty są widoczne w objętości pustej przestrzeni, podczas gdy wysokość piku dla białka będącego przedmiotem zainteresowania zmniejsza się po osiągnięciu temperatury rozwijania.
GFP ma T m ~ 76 ° C, więc technika jest ograniczona do temperatury poniżej ~ 70 ° C.
Test termostabilności wiązania radioligandu
GPCR są farmakologicznie ważnymi białkami transbłonowymi . Ich rentgenowskie struktury krystaliczne zostały ujawnione długo po innych białkach transbłonowych o mniejszym znaczeniu. Trudność w uzyskaniu kryształów białka GPCR wynikała prawdopodobnie z ich dużej elastyczności. Mniej elastyczne wersje otrzymano przez obcięcie, mutację i wstawienie lizozymu T4 do rekombinowanej sekwencji. Jedną z metod zastosowanych przez badaczy do kierowania tymi zmianami był test termostabilności wiązania radioligandu.
Test przeprowadza się przez inkubację białka ze znakowanym radioaktywnie ligandem białka przez 30 minut w danej temperaturze, następnie schłodzenie na lodzie, przepuszczenie przez minikolumnę do filtracji żelowej i określenie ilościowe poziomów promieniowania białka wychodzącego z kolumny. Stężenie radioligandu jest wystarczająco wysokie, aby wysycić białko. Zdenaturowane białko nie jest w stanie związać radioligandu, a białko i radioligand zostaną rozdzielone w minikolumnie do filtracji żelowej. Podczas przeszukiwania mutantów selekcja będzie dotyczyła stabilności termicznej w określonej konformacji, tj. jeśli radioligand jest agonistą, selekcja będzie dotyczyła konformacji wiązania agonisty, a jeśli jest antagonistą, wówczas przeszukiwanie dotyczy stabilności konformacji wiązania antagonisty.
Testy radiowe mają tę zaletę, że pracują z niewielkimi ilościami białka. Ale jest to praca z substancjami radioaktywnymi i wymaga dużej ilości pracy fizycznej. Ligand o wysokim powinowactwie musi być znany dla białka będącego przedmiotem zainteresowania, a bufor nie może zakłócać wiązania radioligandu. Inne testy przesunięcia termicznego mogą również wybrać określone konformacje, jeśli do eksperymentu zostanie dodany ligand odpowiedniego typu.
Porównanie różnych podejść
| termofluor | CPM | DCVJ | Czas życia fluorescencji tryptofanu | Długość fali fluorescencji tryptofanu | Statyczne rozpraszanie światła | FastPP | CETSA | SEC-TS | FSEC-TS | Test termostabilności wiązania radioligandu | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Oczyszczenie | Czyste białko | Czyste białko | Czyste białko w bardzo wysokim stężeniu | Czyste białko | Czyste białko | Czyste białko | Złożona mieszanka | Złożona mieszanka | Czyste białko | Złożona mieszanka | Złożona mieszanka |
| Detergenty | Poniżej CMC | Tak | Tak | Tak | Tak | Tak | Tak (niskie stężenie) | Tak | Tak | Tak | Tak |
| Bufor | Unikaj bardzo wysokiego stężenia. rozpuszczalniki organiczne | Unikaj tioli, ewentualnie innych nukleofili | - | - | - | - | Termolizyna wymaga jonów wapnia | - | - | - | Powinien zmaksymalizować powinowactwo wiązania radioligandu |
| Wydajność | Najwyższy | Najwyższy | Najwyższy | Mediator | Mediator | Mediator | Średnio-niski (jeśli wymagany jest zachodni) | Najniższy (średni z FRET) | Najniższy | Najniższy | Najniższy |
| Wymagania dotyczące kolejności | NIE | Cysteiny, nie na powierzchni i nie w wiązaniach dwusiarczkowych | NIE | Tryptofan | Tryptofan | NIE | Sekwencja musi zawierać reszty hydrofobowe (wymagane do rozszczepienia) | Dla przeciwciała | NIE | Dla znacznika fluorescencyjnego | NIE |
| Wymagania sprzętowe | maszyna qPCR | Maszyna qPCR ze wzbudzeniem UV lub czytnikiem płytek fluorescencyjnych | maszyna qPCR | Wysokoprzepustowy czytnik różnicowej wewnętrznej fluorescencji o żywotności | Wysokoprzepustowy czytnik długości fali z wewnętrzną fluorescencją różnicową | Wysokoprzepustowy czytnik różnicowego rozpraszania światła statycznego | Termocykler (lub łaźnia wodna) i western blot | Termocykler (lub łaźnia wodna) i western blot (lub czytnik FRET) | Termocykler (lub łaźnia wodna) i HPLC | Termocykler (lub łaźnia wodna) i FPLC/HPLC z czytnikiem fluorescencyjnym | Termocykler (lub łaźnia wodna) i licznik scyntylacyjny |
| Etykiety | Tak + DMSO | Tak + DMSO | Tak + DMSO | Bez etykiet | Bez etykiet | Bez etykiet | Bez etykiet | Bez etykiet | Bez etykiet | Tak | radioligand |
| Możliwa interferencja ze strony fluoroforów w buforze | Tak | Tak | Tak | Tak | Tak | NIE | NIE | NIE | NIE | Tak | NIE |
| Białka fuzyjne | NIE | Prawdopodobnie | NIE | Prawdopodobnie | Prawdopodobnie | NIE | Opcjonalny | NIE | NIE | Tak | Tak |
| Działa z białkami, które ulegają fibrylacji po podgrzaniu | NIE | Tak, przynajmniej z beta-laktoglobuliną | Tak | Tak, prawdopodobnie | Tak, prawdopodobnie | Tak | Tak (jeśli cięcie następuje szybciej niż fibrylizacja przy wysokim stężeniu TL) | Tak | Tak | Tak | Tak |
Aplikacje
Badania przesiewowe leków bez etykiet
Thermofluor był szeroko stosowany w kampaniach badań przesiewowych leków. Ponieważ termofluor wykrywa miejsca wiązania o wysokim powinowactwie dla małych cząsteczek na białkach, może znaleźć trafienia, które wiążą się z podmiejscami miejsca aktywnego, miejscami kofaktora lub allosterycznymi miejscami wiązania z równą skutecznością. Sposób typowo wymaga zastosowania przesiewowych stężeń związku przy > 10-krotności pożądanego progu wiązania. Ustawienie 5 μM jako rozsądnego progu trafienia wymaga w konsekwencji stężenia testowego liganda od 50 do 100 μM w studzience z próbką. W przypadku większości bibliotek związków leków, w których wiele związków nie jest rozpuszczalnych powyżej ~100 μM, przeszukiwanie wielu związków jest w konsekwencji niewykonalne ze względu na problemy z rozpuszczalnością. Ekrany termofluorowe nie wymagają opracowywania niestandardowych odczynników przesiewowych (np. rozszczepialnych analogów substratów), nie wymagają żadnych odczynników radioaktywnych i są generalnie mniej wrażliwe na działanie związków, które reagują chemicznie z resztami miejsc aktywnych białek i które w konsekwencji pojawiają się jako niepożądane trafienia w ekranach aktywności enzymów.
Optymalizacja leadów lekowych
Termofluorowe pomiary Tm można ilościowo powiązać z wartościami Kd leku, chociaż wymaga to dodatkowych pomiarów kalorymetrycznych entalpii rozwijania docelowych białek, określonych za pomocą DSC. Zakres dynamiczny testu termofluorowego jest bardzo duży, więc tego samego testu można użyć do znalezienia trafień mikromolowych i optymalizacji odprowadzeń subnanomolowych, co czyni tę metodę szczególnie przydatną w opracowywaniu zależności QSAR w celu optymalizacji odprowadzeń.
Badania mechanizmu działania enzymów
Wiele białek wymaga jednoczesnego lub sekwencyjnego wiązania wielu substratów, kofaktorów i/lub efektorów allosterycznych. Badania termofluorowe cząsteczek, które wiążą się z miejscami aktywnymi, kofaktorami lub allosterycznymi miejscami wiązania, mogą pomóc w wyjaśnieniu specyficznych cech mechanizmu enzymatycznego, które mogą być ważne w projektowaniu skutecznych kampanii przesiewowych leków i charakteryzowaniu nowych mechanizmów hamujących.
Stabilizacja białka dla zoptymalizowanej izolacji
Można przeprowadzić wstępne badania przesiewowe Thermofluor, które pobierają próbki z szerokiego zakresu pH, siły jonowej i dodatków, takich jak dodane jony metali i kofaktory. Generowanie powierzchni odpowiedzi białkowej jest przydatne do ustalenia optymalnych warunków testu i często może prowadzić do ulepszonego schematu oczyszczania wymaganego do wspierania kampanii HTS i badań biofizycznych.
Charakterystyka modyfikowanych białek
Wiele zastosowań inżynierii białek do odkrywania leków lub zastosowań biofizycznych obejmuje modyfikację sekwencji aminokwasowej białka poprzez skrócenie, fuzje domen, modyfikacje specyficzne dla miejsca lub losową mutagenezę. Thermofluor zapewnia wysokowydajną metodę oceny wpływu takich zmian sekwencji na stabilność białka, jak również środki do opracowywania warunków stabilizujących, jeśli jest to wymagane.
Optymalizacja warunków krystalizacji białek
Chociaż białka są strukturami dynamicznymi w roztworze, oczekuje się, że tworzenie kryształów białek będzie faworyzowane, gdy wszystkie cząsteczki znajdują się w konformacji o najniższej energii. Termofluorowa ocena warunków stabilizujących białka jest w konsekwencji użyteczną strategią znajdowania optymalnych warunków krystalizacji
Poszukiwanie inhibitorów oddziaływań białko-białko modulatorów zmian konformacyjnych białek
Ponieważ thermofluor jest testem bez znaczników, który wykrywa wiązanie małych cząsteczek z miejscami wiążącymi o wysokim powinowactwie na docelowym białku, dobrze nadaje się do znajdowania małocząsteczkowych inhibitorów interakcji białko-białko lub miejsc modulacji allosterycznej. Oczywiście to, czy interakcja białko-białko jest ostatecznie „podatna na lek” z małą cząsteczką, wymaga obecności odpowiedniego miejsca wiązania na docelowym białku, które zapewnia wystarczającą liczbę lokalnych oddziaływań energetycznych, aby umożliwić specyficzne wiązanie leku.
ThermoFluor białek błonowych
Białka błonowe są często izolowane w obecności hydrofobowych środków solubilizujących, które mogą rozdzielać barwniki wiążące hydrofobowo, takie jak 1,8-ANS i pomarańczowy SYPRO, i generować tło fluorescencyjne, które zasłania obserwację sygnału topnienia białka termofluorowego. Niemniej jednak staranna optymalizacja warunków (np. w celu uniknięcia tworzenia się miceli środka solubilizującego) może często zapewnić zadowalające warunki testu
Deszyfrowanie białek o nieznanej funkcji biologicznej
Funkcja biochemiczna celów białkowych zidentyfikowanych poprzez nokaut genów lub podejścia proteomiczne jest często niejasna, jeśli mają one niską homologię sekwencji aminokwasowej z białkami o znanej funkcji. W wielu przypadkach pewne przydatne informacje można uzyskać poprzez identyfikację kofaktorów wiążących lub analogów substratów w klasyfikacji funkcji białek, informacje przydatne przy użyciu Thermofluor mogą pomóc w „odszyfrowaniu” funkcji białek, których funkcja biochemiczna mogłaby być w przeciwnym razie nieznana.
Testy równoległego przesunięcia termicznego
Ostatnie osiągnięcia rozszerzyły podejście do przesunięcia termicznego do analizy interakcji ligandów w złożonych mieszaninach, w tym w nienaruszonych komórkach. Wstępne obserwacje poszczególnych białek przy użyciu szybkiej proteolizy równoległej (FastPP) wykazały, że stabilizacja przez wiązanie ligandu może nadawać odporność na trawienie proteolityczne termolizyną. Ochronę w stosunku do odniesienia oceniano ilościowo przez barwienie białek na żelach lub metodą western blotting z przeciwciałem znakującym skierowanym na znacznik połączony z białkiem docelowym. CETSA, test komórkowego przesunięcia termicznego, jest metodą, która monitoruje stabilizujący efekt wiązania leku poprzez zapobieganie nieodwracalnemu wytrącaniu się białka, które jest zwykle inicjowane, gdy białko ulega termicznej denaturacji. W CETSA porcje lizatu komórkowego są przejściowo podgrzewane do różnych temperatur, po czym próbki są wirowane w celu oddzielenia frakcji rozpuszczalnych od wytrąconych białek. Obecność docelowego białka w każdej rozpuszczalnej frakcji jest określana metodą Western blotting i wykorzystywana do konstruowania krzywej topnienia CETSA, która może dostarczać informacji dotyczących celowania in vivo, dystrybucji leku i biodostępności. Zarówno FastPP, jak i CETSA na ogół wymagają przeciwciał w celu ułatwienia wykrywania celu, w związku z czym są one generalnie stosowane w kontekstach, w których tożsamość celu jest znana a priori. Nowsze osiągnięcia mają na celu połączenie aspektów podejść FastPP i CETSA poprzez ocenę zależnej od liganda, zależnej od liganda ochrony proteolitycznej celów w komórkach przy użyciu spektroskopii masowej (MS) w celu wykrycia przesunięć we wzorcach proteolizy związanych ze stabilizacją białek. Obecne implementacje nadal wymagają wiedzy a priori o spodziewanych celach, aby ułatwić analizę danych, ale udoskonalenia strategii gromadzenia danych przez państwa członkowskie wraz z wykorzystaniem ulepszonych narzędzi obliczeniowych i struktur baz danych mogą potencjalnie pozwolić na zastosowanie tego podejścia do odszyfrowywania celów de novo w całości skala proteomu komórki. Byłby to duży postęp w odkrywaniu leków, ponieważ umożliwiłby identyfikację odrębnych celów molekularnych (a także interakcji poza celem) dla leków zidentyfikowanych za pomocą ekranów komórkowych lub fenotypowych leków o dużej zawartości.