faga T7

„Gp5” przekierowuje tutaj. W przypadku innych zastosowań patrz GP5 .

Model strukturalny bakteriofaga T7 w rozdzielczości atomowej

Wirus Escherichia T7
Klasyfikacja wirusów
(nierankingowe):	Wirus
królestwo :	Duplodnaviria
Królestwo:	Heunggongvirae
Gromada:	Urowiricota
Klasa:	Caudoviricetes
Zamówienie:	Caudovirales
Rodzina:	Autographiviridae
Rodzaj:	Wirus teseptima
Gatunek:	Wirus Escherichia T7

Bakteriofag T7 (lub fag T7 ) to bakteriofag , wirus infekujący bakterie. Zakaża większość szczepów Escherichia coli i polega na rozmnażaniu się tych żywicieli. Bakteriofag T7 ma lityczny cykl życiowy , co oznacza, że ​​niszczy zainfekowaną komórkę. Posiada również kilka właściwości, które czynią go idealnym fagiem do eksperymentów: jego oczyszczanie i koncentracja dały spójne wartości w analizach chemicznych; można go uczynić niezakaźnym przez wystawienie na działanie światła UV; i może być stosowany w prezentacji fagowej do klonowania Białka wiążące RNA .

Odkrycie

W badaniu przeprowadzonym w 1945 roku przez Demereca i Fano, T7 został użyty do opisania jednego z siedmiu typów fagów (T1 do T7), które rosną litycznie na Escherichia coli; chociaż wszystkie siedem fagów ponumerowano arbitralnie, później odkryto, że fagi o numerach nieparzystych lub fagi T-nieparzyste mają wspólne cechy morfologiczne i biochemiczne, które odróżniają je od fagów T-parzystych. Zanim fag został fizycznie nazwany T7, był używany we wcześniejszych eksperymentach. Niemiecko-amerykański biofizyk Max Delbrück pracował z tym samym wirusem pod koniec lat trzydziestych XX wieku, nazywając go fagiem δ, oraz francusko-kanadyjski mikrobiolog Félix d'Herelle prawdopodobnie badał swojego bliskiego krewnego w latach dwudziestych XX wieku.

Zastępy niebieskie

T7 rośnie na szorstkich szczepach Escherichia coli (tj. tych, które nie mają pełnej długości polisacharydu O-antygenu na swojej powierzchni) i niektórych innych bakteriach jelitowych , ale bliscy krewni również infekują gładkie, a nawet otoczkowe szczepy. E. coli jest bardziej oporna na T7 niż na inne podobne fagi.

Struktura wirionu

Kolorowa mikrofotografia wirionu T7 z sześcioma włóknami ogona, które są zagięte do tyłu na jego kapsydzie. Włókna rozciągają się, gdy wirus lokalizuje odpowiedniego żywiciela.

Schematyczny rysunek wirionu faga T7 Enterobacteria z adnotacjami (przekrój i widok z boku)

Wirus ma złożoną symetrię strukturalną, z kapsydem faga, który jest dwudziestościenny (dwadzieścia ścian) o wewnętrznej średnicy 55 nm i ogonem o średnicy 19 nm i długości 28,5 nm przymocowanym do kapsydu. Wyrzucanie białek z kapsydu podczas infekcji powoduje, że wirus zmienia strukturę, gdy wchodzi do komórki.

Genom

Genom faga T7 był jednym z pierwszych całkowicie zsekwencjonowanych genomów i został opublikowany w 1983 r. Głowa cząstki faga zawiera około 40 kbp genomu dsDNA , który koduje 55 białek . Genom zawiera liczne nakładające się geny , które częściowo usunięto poprzez „refaktoryzację” genomu w celu wytworzenia T7.1.

Koło życia

Cykl życiowy T7 wynosi 17 minut w temperaturze 37˚C, tj. czas od zakażenia do lizy komórki gospodarza, kiedy uwalniane są nowe fagi. Ze względu na krótki okres utajenia większość badań fizjologicznych przeprowadza się w temperaturze 30˚C, gdzie zakażone komórki ulegają lizie po 30 minutach. Jednak szczepy T7 o wysokiej sprawności zostały wyizolowane z okresem utajenia wynoszącym zaledwie ~11 minut w 37˚C rosnących w optymalnych warunkach w wynikach na bogatych pożywkach. Ten zaadaptowany fag może skutecznie powiększyć swoją populację o ponad 10 ¹³ w ciągu jednej godziny wzrostu.

Infekcja bakterii gospodarza

T7 infekujący komórkę gospodarza . Schematyczny rysunek z adnotacjami.

Tomogramy wirionu T7 w akcji. T7 używa swoich włókien do „chodzenia” po powierzchni komórki i ostatecznie infekuje komórkę.

Cykl reprodukcyjny T7, łącznie

Mechanizm replikacyjny T7, szczegóły

Fag T7 rozpoznaje pewne receptory na powierzchni komórek E. coli i wiąże się z powierzchnią komórki za pomocą wirusowych włókien ogonka. W niektórych szczepach T7 włókna ogonka są zastąpione kolcami ogona, które rozkładają antygeny O lub K na powierzchni komórki poprzez aktywność enzymatyczną .

W procesie adsorpcji i penetracji lizozymy tworzą otwór w warstwie peptydoglikanu ściany komórkowej bakterii, umożliwiając przeniesienie wirusowego DNA do bakterii. Krótki, gruby ogon faga podobnego do T7 jest zbyt krótki, aby objąć otoczkę komórki, a aby wyrzucić genom faga do komórki na początku infekcji, białka wirionu muszą najpierw utworzyć kanał z czubka ogona do cytoplazmy komórki. Fag uwalnia również pięć białek potrzebnych do rozpoczęcia replikacji genomu wirusa i rozszczepienia genomu gospodarza. Bakteriofag T7 został wyewoluowany w celu obejścia kilku mechanizmów obronnych bakterii gospodarza, w tym ściany komórkowej peptydoglikanu i systemie CRISPR . Gdy fag T7 wprowadzi genom wirusa, proces replikacji DNA genomu gospodarza zostaje zatrzymany i rozpoczyna się replikacja genomu wirusa.

W optymalnych warunkach fag T7 może zakończyć proces lityczny w ciągu 25 minut, co prowadzi do śmierci komórki gospodarza E. coli . W czasie lizy wirus może wytworzyć ponad 100 potomstwa.

składniki

Gp5 (kodowany przez gen gp5 ) jest polimerazą DNA faga T7 . Polimeraza T7 wykorzystuje endogenną tioredoksynę E. coli , białko REDOX, jako ślizgowy zacisk DNA podczas replikacji DNA faga (chociaż zwykle tioredoksyna pełni inną funkcję). Zacisk przesuwny utrzymuje polimerazę na DNA, co zwiększa szybkość syntezy.

Replikacja i naprawa DNA

Fag T7 ma najprostszy znany replisom DNA , składający się z helikazy i prymazy , które znajdują się w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym , który tworzy heksamer w obecności DNA i ATP lub dTTP . Polimeraza DNA T7 , wspomagana przez tioredoksynę E. coli , przeprowadza syntezę zarówno wiodącej, jak i opóźnionej nici DNA .

U faga T7 pęknięcia dwuniciowe DNA są prawdopodobnie naprawiane przez wstawienie fragmentu DNA dawcy w szczelinę w miejscu pęknięcia. Ta naprawa pęknięć dwuniciowych jest ułatwiona przez genu 2.5, które promuje hybrydyzację homologicznych komplementarnych nici DNA .

Replikacyjne półprodukty

Replikujący się wewnątrzkomórkowy DNA faga T7, po rozciągnięciu po lizie komórki, jest zwykle dłuższy niż chromosom dojrzałego faga (11 do 15 µM) i może występować w postaci wysoce połączonych liniowych nici do 66 razy dłuższych niż dojrzały fag chromosom. Replikujący się DNA można również zobaczyć w postaci zwiniętych struktur pierścieniowych, które wydają się odpowiadać wielokrotnie zapętlonym konfiguracjom DNA, w których superhelikalne skręty, niezbędne do zagęszczenia DNA, zostały złagodzone przez nacięcie nici podczas lizy komórki.

Zastosowania w biologii molekularnej

Sekwencja promotora T7 jest szeroko stosowana w biologii molekularnej ze względu na jej niezwykle wysokie powinowactwo do polimerazy RNA T7 , a tym samym wysoki poziom ekspresji.

T7 był używany jako model w biologii syntetycznej . Chan i in. (2005) „ zrefaktoryzowali ” genom T7, zastępując około 12 kbp jego genomu zmodyfikowanym DNA. Zmodyfikowany DNA został zaprojektowany tak, aby był łatwiejszy w obróbce na wiele sposobów: poszczególne elementy funkcjonalne zostały oddzielone miejscami endonukleazy restrykcyjnej w celu prostej modyfikacji, a nakładające się domeny kodujące białka zostały rozdzielone i, w razie potrzeby, zmodyfikowane przez ciche mutacje pojedynczej pary zasad . T7 został przetestowany na ludzkim kostniakomięsaku do leczenia komórek nowotworowych.

Linki zewnętrzne

• T7 + Phage w US National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH)
• [1] Strefa Wirusowa
• Nowe Szczegóły dotyczące interakcji T7-host . Magazyn mikrobów
• Proteom referencyjny T7 w Uniprot