Sferoplast
Sferoplast (lub sferoplast w użyciu brytyjskim) to komórka drobnoustroju, z której ściana komórkowa została prawie całkowicie usunięta, na przykład w wyniku działania penicyliny lub lizozymu. Według niektórych definicji terminem tym określa się bakterie Gram-ujemne . Według innych definicji termin ten obejmuje również drożdże . Nazwa sferoplast wynika z faktu, że po strawieniu ściany komórkowej drobnoustroju napięcie błonowe powoduje, że komórka nabiera charakterystycznego, kulistego kształtu. Sferoplasty są delikatne osmotycznie i ulegają lizie jeśli zostanie przeniesiony do roztworu hipotonicznego .
Stosowany do opisania bakterii Gram-ujemnych termin sferoplast odnosi się do komórek, z których usunięto składnik peptydoglikanu , ale nie składnik zewnętrznej błony ściany komórkowej.
Tworzenie się sferoplastów
Sferoplasty indukowane antybiotykami
Różne antybiotyki przekształcają bakterie Gram-ujemne w sferoplasty. Należą do nich peptydoglikanów , takie jak fosfomycyna , wankomycyna , moenomycyna, laktywicyna i antybiotyki β-laktamowe . Antybiotyki, które hamują szlaki biochemiczne bezpośrednio przed syntezą peptydoglikanu, również indukują powstawanie sferoplastów (np. fosmidomycyna , fosfoenolopirogronian ).
Oprócz powyższych antybiotyków, inhibitory syntezy białek (np. chloramfenikol , oksytetracyklina , kilka aminoglikozydów ) i inhibitory syntezy kwasu foliowego (np. trimetoprim , sulfametoksazol ) również powodują tworzenie sferoplastów przez bakterie Gram-ujemne.
Sferoplasty indukowane enzymami
Enzym lizozym powoduje, że bakterie Gram-ujemne tworzą sferoplasty, ale tylko wtedy, gdy stosuje się środek przepuszczający błonę, taki jak laktoferyna lub etylenodiaminotetraoctan (EDTA), aby ułatwić przejście enzymu przez błonę zewnętrzną . EDTA działa jako środek przepuszczający wilgoć, wiążąc się z jonami dwuwartościowymi, takimi jak Ca 2+ i usuwając je z błony zewnętrznej.
Drożdże Candida albicans można przekształcić w sferoplasty przy użyciu enzymów litykazy , chitynazy i β-glukuronidazy .
Zastosowania i zastosowania
Odkrycie antybiotyków
Od lat sześćdziesiątych do dziewięćdziesiątych XX wieku firma Merck and Co. stosowała badanie przesiewowe sferoplastów jako podstawową metodę odkrywania antybiotyków hamujących biosyntezę ściany komórkowej. Na tym ekranie opracowanym przez Eugene'a Dulaneya rosnące bakterie wystawiono na działanie substancji testowych w warunkach hipertonicznych. Inhibitory syntezy ściany komórkowej powodowały, że rosnące bakterie tworzyły sferoplasty. Badania przesiewowe umożliwiły odkrycie fosfomycyny, cefamycyny C , tienamycyny i kilku karbapenemów .
Zaciśnięcie łaty
Specjalnie przygotowane gigantyczne sferoplasty bakterii Gram-ujemnych można wykorzystać do badania funkcji bakteryjnych kanałów jonowych za pomocą techniki zwanej patch-clamp , która pierwotnie została zaprojektowana do charakteryzowania zachowania neuronów i innych pobudliwych komórek. Aby przygotować gigantyczne sferoplasty, bakterie poddaje się działaniu przegrody (np. cefaleksyny ). To powoduje, że bakterie tworzą włókna , wydłużone komórki pozbawione wewnętrznych ścianek poprzecznych. Po pewnym czasie ściany komórkowe włókien są trawione, a bakterie zapadają się w bardzo duże kule otoczone jedynie ich cytoplazmatyczną i zewnętrzną . Membrany można następnie poddać analizie w typu patch-clamp w celu określenia fenotypu osadzonych w nich kanałów jonowych. Często zdarza się również nadekspresja określonego kanału, aby wzmocnić jego efekt i ułatwić jego scharakteryzowanie.
Technikę mocowania łatek gigantycznych sferoplastów E. coli zastosowano do badania natywnych kanałów mechanosensownych (MscL, MscS i MscM) E. coli . Został on rozszerzony w celu zbadania innych ulegających ekspresji heterologicznej i wykazano, że gigantyczny sferoplast E. coli może być stosowany jako system ekspresji w kanale jonowym porównywalny z oocytem Xenopus .
Liza komórek
drożdży są zwykle chronione przez grubą ścianę komórkową , co utrudnia ekstrakcję białek komórkowych. [ potrzebne źródło ] Enzymatyczne trawienie ściany komórkowej zymoliazą, tworzące sferoplasty, czyni komórki podatnymi na łatwą lizę pod wpływem detergentów lub szybkich zmian ciśnienia osmolarnego.
Transfekcja
transfekcji komórek zwierzęcych można zastosować sferoplasty bakteryjne, do których wprowadzono odpowiedni rekombinowany DNA . Sferoplasty z rekombinowanym DNA wprowadza się do pożywek zawierających komórki zwierzęce i poddaje fuzji z glikolem polietylenowym (PEG). Dzięki tej metodzie prawie 100% komórek zwierzęcych może pobrać obce DNA. Po przeprowadzeniu eksperymentów według zmodyfikowanego Hanahana z użyciem chlorku wapnia w E. coli ustalono, że sferoplasty mogą być zdolne do transformacji przy 4,9x10-4 .
Zobacz też
Linki zewnętrzne
- Sferoplasty w Narodowej Bibliotece Medycznej Stanów Zjednoczonych Nagłówki przedmiotów medycznych (MeSH)