Drożdżowa platforma ekspresyjna
Drożdżowa platforma ekspresyjna to szczep drożdży używany do produkcji dużych ilości białek , cukrów lub innych związków do celów badawczych lub przemysłowych. Podczas gdy drożdże są często bardziej zasobochłonne w utrzymaniu niż bakterie , niektóre produkty mogą być wytwarzane tylko przez komórki eukariotyczne , takie jak drożdże, co wymaga użycia drożdżowej platformy ekspresyjnej. Drożdże różnią się produktywnością i zdolnością wydzielania przetwarzać i modyfikować białka. Jako takie, różne typy drożdży (tj. różne platformy ekspresyjne) lepiej nadają się do różnych zastosowań badawczych i przemysłowych.
Produkty
Od początku inżynierii genetycznej opracowano szereg mikroorganizmów do produkcji produktów biologicznych. Produkty te są wykorzystywane w medycynie i przemyśle do tworzenia farmaceutyków, takich jak szczepionki przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B czy insulina . Wspólne platformy rozwoju leków i innych produktów obejmują bakterię E. coli oraz kilka komórek drożdży i ssaków (w tym zwłaszcza komórki jajnika chomika chińskiego ). Ogólnie rzecz biorąc, mikroorganizm wykorzystywany jako platforma ekspresyjna musi spełniać kilka kryteriów: powinien być w stanie szybko rosnąć w dużych pojemnikach, wytwarzać białka w sposób wydajny (tj. produkować i modyfikować produkty tak, aby były jak najbardziej gotowe do spożycia przez ludzi.
Zastosowane szczepy
Drożdże są powszechnymi żywicielami do produkcji białek z rekombinowanego DNA . Oferują stosunkowo łatwą manipulację genetyczną i szybki wzrost do wysokich gęstości komórek na niedrogich podłożach. Jako eukarionty są w stanie przeprowadzać modyfikacje białek, takie jak glikozylacja , które są powszechne w komórkach eukariotycznych, ale stosunkowo rzadkie w bakteriach. Dzięki temu drożdże mogą wytwarzać złożone białka, które są identyczne lub bardzo podobne do rodzimych produktów roślinnych lub ssaków. Pierwsza platforma do ekspresji drożdży została oparta na drożdżach piekarniczych Saccharomyces cerevisiae . Jednak od tego czasu zbadano różne platformy ekspresyjne drożdży, które są szeroko stosowane w różnych zastosowaniach w oparciu o ich różne cechy i możliwości. Na przykład niektóre z nich rosną na szerokiej gamie źródeł węgla i nie ograniczają się do glukozy , jak ma to miejsce w przypadku drożdży piekarskich. Kilka z nich znajduje również zastosowanie w inżynierii genetycznej i produkcji obcych białek.
Arxula adeninivorans
Arxula adeninivorans (zwany także Blastobotrys adeninivorans ) to drożdże dimorficzne, co oznacza, że rosną jako pączkujące drożdże do temperatury 42°C, ale w wyższych temperaturach jako forma nitkowata . A. adeninivorans ma niezwykłe właściwości biochemiczne. Może rosnąć na szerokiej gamie podłoży i może asymilować azotany. Opracowano szczepy A. adeninivorans , które mogą wytwarzać naturalne tworzywa sztuczne, i były zaangażowane w rozwój bioczujnika estrogenów w próbkach środowiskowych.
Candida boidinii
Candida boidinii to drożdże wyróżniające się zdolnością do wzrostu na metanolu (tzw. metylotrofizm). Podobnie jak inne gatunki metylotroficzne, takie jak Hansenula polymorpha i Pichia pastoris , jest wykorzystywana jako platforma do produkcji obcych białek. Zgłaszano wydajności w zakresie wielu gramów wydzielanego obcego białka. Metoda obliczeniowa IPRO przewidziała niedawno mutacje, które eksperymentalnie zmieniły specyficzność kofaktora reduktazy ksylozy Candida boidinii z NADPH na NADH.
Ogataea polymorpha
Ogataea polymorpha (synonimy Hansenula polymorpha lub Pichia angusta ) to kolejne drożdże metylotroficzne (patrz Candida boidinii ). Może rosnąć na szerokiej gamie innych podłoży; jest termotolerancyjny i może asymilować azotany (patrz także Kluyveromyces lactis ). Został zastosowany do produkcji szczepionek przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B, insuliny i interferonu alfa-2a do leczenia wirusowego zapalenia wątroby typu C, a także szeregu enzymów technicznych.
Kluyveromyces lactis
Kluyveromyces lactis to drożdże regularnie wykorzystywane do produkcji kefiru . Może rosnąć na kilku cukrach, przede wszystkim na laktozie , która jest obecna w mleku i serwatce. Z powodzeniem zastosowano go m.in. do produkcji chymozyny (enzymu zwykle występującego w żołądku cieląt) do produkcji sera. Produkcja odbywa się w fermentorach w skali 40 000 L.
Pichia pastoris
Pichia pastoris to drożdże metylotroficzne (patrz Candida boidinii i Hansenula polymorpha ). Stanowi wydajną platformę do produkcji obcych białek. Elementy platformy są dostępne jako zestaw i są stosowane na całym świecie w środowisku akademickim do produkcji białek. Opracowano szczepy, które mogą wytwarzać złożony ludzki N-glikan (glikany drożdżowe są podobne, ale nie identyczne do tych występujących u ludzi.
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae to tradycyjne drożdże piekarskie szeroko stosowane w browarnictwie i piekarnictwie. Często w odniesieniu do tego pojedynczego gatunku używa się zbiorczego terminu „drożdże”. Jako platforma ekspresyjna została z powodzeniem zastosowana do produkcji enzymów technicznych i farmaceutyków, takich jak insulina i szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B.
Yarrowia lipolytica
Yarrowia lipolytica to drożdże dimorficzne (patrz Arxula adeninivorans ), które mogą rosnąć na wielu różnych podłożach. W związku z tym ma duży potencjał zastosowań przemysłowych, ale nie ma jeszcze dostępnych na rynku produktów rekombinowanych.
Używać
Różne drożdżowe platformy ekspresyjne różnią się kilkoma cechami charakterystycznymi, w tym wydajnością i zdolnościami do wydzielania, przetwarzania i modyfikowania białek w poszczególnych przykładach. Jednak zastosowania wszystkich platform wyrażeń mają pewne podstawowe podobieństwa.
W celu wytworzenia pożądanego produktu, odpowiednie szczepy drożdży transformuje się wektorem, który zawiera wszystkie niezbędne elementy genetyczne do wytworzenia interesującego produktu biologicznego. Wektory muszą również zawierać znacznik selekcyjny , który jest wymagany do wyselekcjonowania drożdży, które pomyślnie przyjęły wektor od tych, które tego nie zrobiły. Wektory zawierają również pewne elementy DNA umożliwiające drożdżom włączenie obcego DNA do chromosomu drożdży i jego replikację. Co najważniejsze, wektory zawierają segment odpowiedzialny za produkcję pożądanego związku, zwany an kaseta ekspresyjna . Kaseta zawiera sekwencję elementów regulacyjnych, które kontrolują, ile iw jakich okolicznościach ostatecznie wytwarzany jest określony produkt. Następnie następuje gen samego produktu biologicznego. Kaseta ekspresyjna jest zakończona sekwencją terminatora, która zatrzymuje transkrypcję eksprymowanego genu.
- Gellissen G (red.) (2005) Produkcja rekombinowanych białek - nowe mikrobiologiczne i eukariotyczne systemy ekspresyjne. Wiley-VCH, Weinheim. ISBN 3-527-31036-3