Pichia pastoris

Klasyfikacja naukowa
Pichia pastoris
Królestwo:	Grzyby
Gromada:	Ascomycota
Klasa:	drożdżaki
Zamówienie:	drożdżaki
Rodzina:	Saccharomycetaceae
Rodzaj:	Pichia / Komagataella
Gatunek:	pastoris
Nazwa dwumianowa
Pichia pastoris

Pichia pastoris to gatunek drożdży metylotroficznych . Został znaleziony w latach 60. XX wieku, z jego cechą wykorzystania metanolu jako źródła węgla i energii. Po latach badań P. pastoris był szeroko stosowany w badaniach biochemicznych i przemyśle biotechnologicznym . Mając duży potencjał jako system ekspresyjny do produkcji białek , a także jako organizm modelowy do badań genetycznych, P. pastoris stało się ważne dla badań biologicznych i zastosowań biotechnologicznych. W ostatniej dekadzie niektóre doniesienia ponownie przypisywały P. pastoris do rodzaju Komagataella za pomocą analizy filogenetycznej , poprzez sekwencjonowanie genomu P. pastoris . Rodzaj został podzielony na K. phaffii , K. pastoris i K. pseudopastoris .

P. pastoris w przyrodzie

Naturalne środowisko

W naturze P. pastoris występuje na drzewach, takich jak kasztanowce . Są heterotrofami i mogą wykorzystywać do życia kilka źródeł węgla, takich jak glukoza , glicerol i metanol . Nie mogą jednak używać laktozy .

Reprodukcja

P. pastoris może podlegać zarówno rozmnażaniu bezpłciowemu , jak i płciowemu przez pączkowanie i askospory . W tym przypadku istnieją dwa typy komórek P. pastoris : komórki haploidalne i diploidalne . W bezpłciowym cyklu życiowym komórki haploidalne przechodzą mitozę w celu rozmnażania. W cyklu życia płciowego komórki diploidalne przechodzą sporulację i mejozę . Tempo wzrostu jego kolonii może zmieniać się w szerokim zakresie, od bliskiego 0 do czasu podwojenia wynoszącego jedną godzinę, co jest odpowiednie dla procesów przemysłowych.

P. pastoris jako organizm modelowy

W ciągu ostatnich kilku lat P. pastoris był badany i zidentyfikowany jako dobry organizm modelowy z kilkoma zaletami. Po pierwsze, P. pastoris można łatwo hodować i wykorzystywać w laboratorium. Podobnie jak inne szeroko stosowane modele drożdży, ma stosunkowo krótką żywotność i szybki czas regeneracji. Co więcej, zaprojektowano kilka niedrogich pożywek hodowlanych, aby P. pastoris mógł na nich szybko rosnąć z dużą gęstością komórek. Przeprowadzono sekwencjonowanie całego genomu P. pastoris . P. pastoris Genom GS115 został zsekwencjonowany przez Flanders Institute for Biotechnology i Ghent University i opublikowany w Nature Biotechnology . Sekwencję genomu i adnotację genu można przeglądać w ORCAE . Kompletne dane genomowe pozwalają naukowcom zidentyfikować białka homologiczne i związki ewolucyjne między innymi gatunkami drożdży a P. pastoris . Co więcej, P. pastoris to pojedyncze komórki eukariotyczne , co oznacza, że ​​naukowcy mogą badać białka wewnątrz P. pastoris . Następnie można przetworzyć homologiczne porównanie z innymi, bardziej skomplikowanymi gatunkami eukariotycznymi, aby uzyskać ich funkcje i pochodzenie.

Kolejną zaletą P. pastoris jest podobieństwo do dobrze przebadanego modelu drożdży — Saccharomyces cerevisiae . Jako organizm modelowy dla biologii, S. cerevisiae były dobrze badane przez dziesięciolecia i wykorzystywane przez naukowców do różnych celów na przestrzeni dziejów. Dwa rodzaje drożdży; Pichia i Saccharomyces mają podobne warunki wzrostu i tolerancje; w ten sposób kultura P. pastoris może być adoptowana przez laboratoria bez wielu modyfikacji. Ponadto, w przeciwieństwie do S. cerevisiae , P. pastoris ma zdolność funkcjonalnego przetwarzania białek o dużej masie cząsteczkowej, co jest przydatne w gospodarzu translacyjnym. Biorąc pod uwagę wszystkie zalety, P. pastoris może być z pożytkiem wykorzystany zarówno jako genetyczny, jak i eksperymentalny organizm modelowy.

P. pastoris jako genetyczny organizm modelowy

Jako genetyczny organizm modelowy, P. pastoris może być wykorzystywany do analizy genetycznej i krzyżowania genetycznego na dużą skalę , z pełnymi danymi genomu i jego zdolnością do przeprowadzania złożonego eukariotycznego przetwarzania genetycznego w stosunkowo małym genomie. Funkcjonalne geny do peroksysomów badano przez porównanie dzikich i zmutowanych szczepów P. pastoris .

P. pastoris jako eksperymentalny organizm modelowy

Jako eksperymentalny organizm modelowy P. pastoris był używany głównie jako system gospodarza do transformacji. Ze względu na jego zdolności do rekombinacji z obcym DNA i przetwarzania dużych białek przeprowadzono wiele badań w celu zbadania możliwości wytwarzania nowych białek i funkcji sztucznie zaprojektowanych białek z wykorzystaniem P. pastoris jako gospodarza transformacji. W ostatniej dekadzie P. pastoris został zaprojektowany do budowy platform systemu ekspresyjnego , co jest typowym zastosowaniem dla standardowego eksperymentalnego organizmu modelowego, jak opisano poniżej.

P. pastoris jako platforma systemu ekspresyjnego

P. pastoris jest często używany jako układ ekspresyjny do wytwarzania białek heterologicznych . Kilka właściwości sprawia, że ​​P. pastoris nadaje się do tego zadania. Obecnie do celów biotechnicznych wykorzystuje się kilka szczepów P. pastoris , przy czym występują między nimi znaczne różnice we wzroście i produkcji białka. Niektóre powszechne warianty posiadają mutację w genie HIS4 , co prowadzi do selekcji komórek, które są pomyślnie transformowane wektorami ekspresyjnymi . Technologia integracji wektorów do P. pastoris jest podobny do genomu Saccharomyces cerevisiae .

Korzyść

1: P. pastoris jest w stanie rosnąć na prostym, niedrogim podłożu, z dużą szybkością wzrostu. P. pastoris może rosnąć w kolbach do wytrząsania lub w fermentorze , dzięki czemu nadaje się zarówno do produkcji na małą, jak i na dużą skalę.

2: P. pastoris ma dwa geny oksydazy alkoholowej , Aox1 i Aox2 , które zawierają silnie indukowalne promotory . Te dwa geny pozwalają Pichii wykorzystywać metanol jako źródło węgla i energii. Promotory AOX są indukowane przez metanol i tłumione przez glukozę . Zwykle gen dla pożądanego białka jest wprowadzany pod kontrolą Aox1 promotora, co oznacza, że ​​produkcję białka można indukować przez dodanie metanolu do pożywki. Po kilku badaniach naukowcy odkryli, że promotor pochodzący z genu AOX1 w P. pastoris jest niezwykle odpowiedni do kontrolowania ekspresji obcych genów, które zostały przekształcone w genom P. pastoris , wytwarzając heterologiczne białka.

3: Z kluczową cechą , P. pastoris może rosnąć z bardzo dużą gęstością komórek w hodowli. Cecha ta jest kompatybilna z ekspresją białek heterologicznych, dając wyższą wydajność produkcji.

4: Technologia wymagana do genetycznej manipulacji P. pastoris jest podobna do tej stosowanej w przypadku Saccharomyces cerevisiae , który jest jednym z najlepiej zbadanych organizmów modelowych drożdży. W rezultacie protokół eksperymentu i materiały są łatwe do zbudowania dla P. pastoris .

Niekorzyść

Ponieważ niektóre białka wymagają białek opiekuńczych do prawidłowego fałdowania, Pichia nie jest w stanie wyprodukować wielu białek, ponieważ P. pastoris nie zawiera odpowiednich białek opiekuńczych. Technologie wprowadzania genów ssaczych białek opiekuńczych do genomu drożdży i nadekspresji istniejących białek opiekuńczych wciąż wymagają udoskonalenia.

Porównanie z innymi systemami ekspresji

W standardowych badaniach biologii molekularnej bakteria Escherichia coli jest najczęściej wykorzystywanym organizmem do układu ekspresyjnego do produkcji białek heterologicznych , ze względu na jej cechy szybkiego tempa wzrostu, wysokiego tempa produkcji białka, a także niewymagających warunków wzrostu. Produkcja białka w E. coli jest zwykle szybsza niż w P. pastoris , z następujących powodów: Kompetentne komórki E. coli można przechowywać zamrożone i rozmrozić przed użyciem, podczas gdy Pichia komórki muszą być wyprodukowane bezpośrednio przed użyciem. Wydajność ekspresji w Pichia różni się w zależności od różnych klonów , tak więc duża liczba klonów musi zostać przebadana pod kątem produkcji białka, aby znaleźć najlepszego producenta. Największą przewagą Pichia nad E. coli jest to, że Pichia jest zdolna do tworzenia wiązań dwusiarczkowych i glikozylacji w białkach, ale E. coli nie. E coli może wytwarzać nieprawidłowo sfałdowane białko, gdy dwusiarczki są zawarte w produkcie końcowym, co prowadzi do nieaktywnych lub nierozpuszczalnych form białek.

Dobrze przebadany Saccharomyces cerevisiae jest również używany jako system ekspresyjny z podobnymi zaletami w stosunku do E. coli jak Pichia . Jednak Pichia ma dwie główne zalety w porównaniu z S. cerevisiae w warunkach laboratoryjnych i przemysłowych:

1. Pichia , jak wspomniano powyżej, jest metylotrofem , co oznacza, że ​​może rosnąć z prostym metanolem, jako jedynym źródłem energii — Pichia może szybko rosnąć w zawiesinie komórek z dość silnym roztworem metanolu, który zabiłby większość innych mikroorganizmów. W tym przypadku system wyrażania jest tani w konfiguracji i utrzymaniu.
2. Pichia może dorastać do bardzo dużej gęstości komórek. W idealnych warunkach może namnażać się do punktu, w którym zawiesina komórek jest praktycznie pastą. Ponieważ wydajność białka z systemu ekspresyjnego w drobnoustroju jest w przybliżeniu równa iloczynowi białek wytwarzanych na komórkę, co sprawia, że ​​Pichia jest bardzo przydatna przy próbach wytworzenia dużych ilości białka bez drogiego sprzętu.

W porównaniu z innymi systemami ekspresyjnymi, takimi jak komórki S2 z Drosophila melanogaster i komórki jajnika chomika chińskiego , Pichia zwykle daje znacznie lepsze plony. Ogólnie rzecz biorąc, linie komórkowe z organizmów wielokomórkowych wymagają złożonych i kosztownych rodzajów pożywek, w tym aminokwasów , witamin , a także innych czynników wzrostu . Tego typu pożywki znacznie zwiększają koszt produkcji białek heterologicznych. Dodatkowo od Pichii może rosnąć w pożywkach zawierających tylko jedno źródło węgla i jedno źródło azotu , co jest odpowiednie do zastosowań związanych ze znakowaniem izotopowym, takich jak białka NMR .

Zastosowania przemysłowe

P. pastoris był używany w kilku gałęziach przemysłu biotechnologicznego, takich jak przemysł farmaceutyczny . Wszystkie zastosowania opierają się na jego funkcji wyrażania białek.

Produkcja bioterapeutyczna

W ciągu ostatnich kilku lat Pichia pastoris wykorzystano do produkcji ponad 500 rodzajów bioterapeutyków , takich jak IFNγ . Na początku wadą tego układu ekspresji białek jest nadmierna glikozylacja przy dużej gęstości struktury mannozy , która jest potencjalną przyczyną immunogenności . W 2006 roku grupie badawczej udało się stworzyć nowy szczep o nazwie YSH597. Ten szczep może eksprymować erytropoetynę w swojej normalnej postaci glikozylacji, poprzez wymianę enzymów odpowiedzialnych za glikozylację typu grzybowego na homologi ssaków. Tak więc zmieniony wzór glikozylacji umożliwił pełną funkcjonalność białka.

Produkcja enzymów dla przemysłu spożywczego

W przemyśle spożywczym, takim jak browar i piekarnia, Pichia pastoris jest wykorzystywana do produkcji różnego rodzaju enzymów, jako substancje pomocnicze w przetwórstwie i dodatki do żywności o wielu funkcjach. Na przykład niektóre enzymy wytwarzane przez genetycznie zmodyfikowaną Pichia pastoris mogą utrzymać miękkość chleba. Tymczasem w piwie enzymy mogłyby być stosowane w celu obniżenia stężenia alkoholu.