Euglenoficyna
Euglenoficyna jest ichtiotoksycznym związkiem wyizolowanym z Euglena sanguinea , protista z rodzaju Euglena . Wykazuje działanie przeciwnowotworowe i chwastobójcze in vitro .
|
|
| Nazwy | |
|---|---|
|
nazwa IUPAC
4-(6-((1E , 3E , 7Z ) -undeka-1,3,7-trien-1-ylo)piperydyn-2-ylo)butan-1-ol
|
|
| Identyfikatory | |
|
Model 3D ( JSmol )
|
|
|
Identyfikator klienta PubChem
|
|
|
Pulpit nawigacyjny CompTox ( EPA )
|
|
|
|
|
|
| Nieruchomości | |
| C20H35NO _ _ _ _ _ | |
| Masa cząsteczkowa | 305,506 g·mol -1 |
|
O ile nie zaznaczono inaczej, dane podano dla materiałów w stanie normalnym (przy 25°C [77°F], 100 kPa).
|
|
Historia
Znanych jest wiele glonów słodkowodnych, które wytwarzają toksyny, w tym euglenoidy ( Euglenophyceae). Stwierdzono, że glony te żyją w środowiskach słodkowodnych na całym świecie. Wiele euglenoidów jest heterotroficznych , ponieważ żywią się poprzez fagocytozę lub prostą dyfuzję. Jednak monofiletyczna grupa alg jest miksotroficzna , a mianowicie Rapaza Viridis, co oznacza, że przełącza się między fotosyntezą , pochłanianiem składników odżywczych i pochłanianiem innych eukariontów. Ponadto Eutreptialis i Euglenales są autotrofami, ponieważ zawierają chlorofil do przeprowadzania fotosyntezy. Euglenoidy mogą zawierać chlorofil i dodatkowy pigment i/lub astaksantynę (karotenoid), dzięki czemu mogą być zabarwione na zielono lub czerwono. Chociaż tę algę znaleziono stosunkowo wcześnie w historii, naukowcom zajęło trochę czasu odkrycie, że wytwarza ona toksynę euglenoficynę, ponieważ żadne wcześniejsze doniesienia nie zidentyfikowały toksyn euglenoidowych. Według ostatnich badań euglenoficyna jest wytwarzana w co najmniej sześciu gatunkach glonów euglenoidowych i sześciu z siedmiu szczepów Euglena Sanguinea. Inne badania koncentrują się na potencjalnym zastosowaniu euglenoficyny jako leku przeciwnowotworowego.
Odkrycie
W 2002 roku ponad 21 000 bassów pręgowanych padło w ciągu dwóch miesięcy w zakładzie akwakultury w Północnej Karolinie. Mniej więcej w tym samym okresie w Stanach Zjednoczonych zgłoszono 12 bardziej toksycznych zakwitów glonów, co spowodowało znacznie większą śmiertelność ryb. W wyniku tych wydarzeń utracono łącznie 1,1 miliona dolarów. Nie znaleziono żadnej widocznej przyczyny zatrucia, z wyjątkiem zaczerwienionej tkanki skrzeli. Próbki wody pobrane ze stawu zawierały ponad 99% eugleny.
W 2004 roku wodę stawową poddano seryjnemu frakcjonowaniu i rozdzieleniu na związki rozpuszczone, bakterie i frakcje glonów, które poddano badaniom. Stwierdzono, że toksyna, która spowodowała wysoką śmiertelność, jest niebiałkowa, stabilna po podgrzaniu do 30°C przez 10 minut i zachowuje aktywność po zamrożeniu w temperaturze -80°C przez 60 dni. Komórki z Euglena zostały wyizolowane, a analiza mikroskopowa potwierdziła tożsamość gatunku jako Euglena Sanguinea i zidentyfikowała toksynę jako euglenoficynę.
Identyfikacja
Ze względu na skomplikowaną morfologię chloroplastów , opisaną jako „osobliwy system chromatoforowy”, identyfikacja E. sanguinea za pomocą technik mikroskopowych pozostaje wyzwaniem. Dlatego do weryfikacji gatunków należy stosować metody oparte na danych molekularnych.
W 2013 r. opracowano analizę MS/MS w celu identyfikacji i ilościowego określenia poziomów euglenoficyny w zbiornikach słodkiej wody. Aby stworzyć standardy eksperymentalne do tej analizy, euglenoficynę oczyszczono za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z kultur klonalnych E. Sanguinea, które wyizolowano z przypadków śmiertelności w Północnej Karolinie i Teksasie. Figura 1A przedstawia analizę spektrometrii mas oczyszczonej euglenoficyny (500 ng), a figura 1B euglenoficyny wyekstrahowanej z hodowli E. Sanguinea.
Rycina 1. Analiza spektrometrii mas euglenoficyny. A. Widmo masowe 500 ng oczyszczonej euglenoficyny. B. Widmo masowe euglenoficyny wyekstrahowanej z hodowli E. Sanguinea. PŁYTA CD. Widmo masowe 1 ng euglenoficyny.
W celu swoistego wykrywania euglenoficyny opracowano metodę monitorowania wielu reakcji (MRM) . Metoda ta opiera się na trzech przejściach: m/z 288,3 do m/z 97,2, 110,2 i 136,2. Spośród tych trzech przejść m/z 110,2 wybrano jako jon kwantyfikujący, ponieważ był to jon produkcyjny o największej intensywności. Ryc. 1C i 1D przedstawiają wykrywanie 1 ng euglenoficyny.
Inną metodą monitorowania stawów słodkowodnych jest test reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) . W 2017 r. test ten został udoskonalony, aby wykrywać euglenoficynę w wodach zasiedlonych przez zakwity E. Sanguinea. Dokonano tego w oparciu o znacznie długie sekwencje SSU rDNA znalezione w gatunkach alg. Stosując zagnieżdżoną PCR, można zredukować wiązanie niespecyficzne z powodu amplifikacji nieoczekiwanych miejsc wiązania starterów. Swoistość tego testu została potwierdzona wynikami PCR gatunków blisko spokrewnionych z E. Sanguinea. W tych testach nie zaobserwowano żadnych produktów. Ponadto z sekwencji nukleotydów można uzyskać dodatkowe informacje, co pozwala na badanie, klasyfikację i porównanie próbki.
W połączeniu z metodami spektrometrii mas, testy PCR ułatwiają monitorowanie i ocenę ryzyka wód słodkich zamieszkanych przez toksyczne zakwity E. Sanguinea.
Struktura i reaktywność
Euglenoficyna wytwarzana przez euglenoidy jest dipodstawioną piperydyną, ponieważ składa się z pierścienia piperydynowego z łańcuchem bocznym butanolu na pozycji 6 i łańcuchem bocznym (1E,3E,7Z)-1,3,7-undekatrienu na pozycji 2. Łańcuch boczny w pozycji 2 ma sprzężony układ, który nadaje mu absorbancję przy 238 nm. Zarówno pozycja 2, jak i 6 w pierścieniu piperydyny są centrami chiralnymi , a zatem ich kombinacja określa stereoizomerię cis/trans związku. Zgodnie z analizą NMR po ekstrakcji, większość euglenoficyny wytwarzanej przez euglenoidy ma konformację cis w odniesieniu do pozycji 2 i 6. Jednak absolutna stereoizomeria cis/trans pozostaje do odkrycia. Ponadto każde wiązanie podwójne jest centrum stereoizomerii E/Z, co w połączeniu ze stereoizomerią cis/trans daje w sumie 12 stereoizomerów (teoretycznie).
Chociaż atomy azotu i tlenu są zdolne do tworzenia wiązań wodorowych, związek ten jest nierozpuszczalny w wodzie i bardzo stabilny w rozpuszczalnikach organicznych, co jest zgodne z przewidywaną in silico wartością log(p) ~5,6. Co ciekawe, struktura euglenoficyny, z wyjątkiem łańcucha bocznego butanolu, jest bardzo podobna do solenopsyny, głównego składnika jadu mrówek ognistych. Dlatego ścieżka syntezy, reaktywność, właściwości chemiczne i toksyczność tych związków mogą być do siebie podobne. Skuteczność solenopsyny jako leku przeciwnowotworowego skłoniła naukowców do zbadania potencjału euglenoficyny również w przypadku podobnego leku. Sekcja „Mechanizmy działania” bardziej szczegółowo omawia ten aspekt.
Biosynteza
Jest bardzo prawdopodobne, że euglenoficyna jest wytwarzana przez enzymy znane jako syntazy poliketydowe (PKS), które są powszechnie spotykane w euglenoidach, a także w innych algach wytwarzających poliketydy.
4.1 Oszacowania oparte na podobieństwie strukturalnym szlaków biosyntezy
Mechanizm, dzięki któremu euglenoidy wytwarzają euglenoficynę, nie jest jeszcze znany. Jednak szacunki można przeprowadzić na tej ścieżce ze względu na podobieństwa strukturalne euglenoficyny do wielu innych naturalnie występujących związków, ale takie szacunki należy traktować z najmniejszą ostrożnością, ponieważ nie są one naukowo udowodnione.
Chociaż solenopsyna wytwarzana przez mrówkę ognistą wykazuje duże podobieństwo strukturalne do euglenoficyny, nie wiadomo, czy szlaki syntezy tych toksyn są również podobne, co może mieć miejsce w przypadku zbieżnej ewolucji tego szlaku.
Co ciekawe, Jeanne N. Tawara i wsp. (1993) badali toksyczne alkaloidy piperydyny z drzew sosny (Pinus) i świerka (Picea), które są strukturalnie podobne do euglenoficyny i również pochodzą z poliketydu (ryc. 2).
Z powodu tego wyjątkowego podobieństwa w obu strukturach, z wyjątkiem łańcucha bocznego i pochodzenia, prawdopodobne jest, że szlak syntezy tych związków jest podobny do euglenoficyny, biorąc pod uwagę ewolucyjny związek między algami a drzewami. To samo dotyczy koniiny, znanej również jako „zabójca Sokratesa”, która jest kolejnym związkiem, który wydaje się być jeszcze bardziej podobny do euglenoficyny i został zbadany przez Hannu Hotti i Heiko Rischer (ryc. 3).
Badacze obu grup związków przypominających euglenoficynę podjęli próbę wyjaśnienia szlaku syntezy. Ścieżki syntezy zaproponowane przez oba zespoły badaczy w dużym stopniu pokrywają się i wydają się uzupełniać. Po pierwsze, proponuje się, aby octan był sprzężony z koenzymem A, tworząc acetylo-CoA. Jest on następnie przekształcany w butyrylo- i malonylo-CoA, z których pierwszy jest katalizowany przez syntetazę kwasów tłuszczowych (FAS). Następnie syntaza poliketydowa łączy te dwa związki, tworząc poliketydowy związek pośredni, którego dokładna struktura nie została jeszcze potwierdzona (ryc. 3). Ten związek pośredni jest następnie redukowany do ketokwasu, a następnie do ketoaldehydu. Następnie L-alanina:aminotransferaza (AAT) przekształca ten ostatni związek w związek ketoaminowy, który spontanicznie cyklizuje i jest redukowany do podstawionego związku piperydynowego znanego jako γ-koniceina (ryc. 4).
Inne enzymy mogą katalizować dodawanie różnych łańcuchów bocznych do tych piperydyn, dając szereg związków na bazie piperydyny (ryc. 4). Badacze toksyn sosnowych i świerkowych zaproponowali strukturę półproduktu poliketydowego i potwierdzili, że łańcuchy boczne piperydyny ulegają modyfikacji po cyklizacji. Badania nie potwierdziły jeszcze tych ścieżek syntezy ze stuprocentową pewnością, jednak szacuje się, że euglenoidy wykorzystują te same mechanizmy do produkcji euglenoficyny.
Toksyczność
Po pierwszej identyfikacji euglenoficyny ryby narażone na działanie komórek E. Sanguinea wykazywały objawy dezorientacji, przyspieszonego oddychania i niezdolności do utrzymania równowagi. Ryby te wykazywały również zaczerwienioną tkankę skrzelową, ale nie stwierdzono krwotoku. Na podstawie zmian behawioralnych, które towarzyszyły tym objawom, amerykańscy naukowcy zasugerowali, że toksyna działa jak neurotoksyna.
Niedojrzałe sumy testowane z frakcjami alg przez Zimba i in. (2004) padły w ciągu 2 godzin od ekspozycji. Później Zimba i wsp. (2009) potwierdzili te śmiertelności, gdy sum wystawiony na oczyszczoną euglenoficynę zdechł w ciągu 30 minut od ekspozycji.
Chociaż euglenoficyna jest wytwarzana w co najmniej sześciu innych gatunkach euglenoidów, E. Sanguinea wydaje się być jedynym gatunkiem, który stanowi poważny problem dla akwakultury, a tym samym dla gospodarki. Wynika to z faktu, że E. Sanguinea tworzy znacznie gęstsze toksyczne kwiaty.
Zimba i in. (2009) badali toksyczność euglenoficyny wobec pięciu gatunków alg: Oocystis polymorpha, Gonphonema parvulum, Microcystis aeruginosa, Planktothrix PCC7811 i Scenedesmus dimorphus. Euglenoficyna hamowała wzrost wszystkich pięciu gatunków, a we wszystkich przypadkach hamowanie było znaczące przy stężeniach <300 ppb.
Mechanizmy działania
Chociaż synteza euglenoficyny nie jest jeszcze w pełni poznana, eksperymenty wykazały, że euglenoidy w hodowli wytwarzają euglenoficynę niezależnie od ich stanu wzrostu. Może to wskazywać, że euglenoficyna jest częścią mechanizmu obronnego glonów.
Euglenoficynę zidentyfikowano całkiem niedawno, więc dokładny mechanizm pozostaje niejasny. Jednak euglenoficyna jest strukturalnie bardzo podobna do solenopsyny. Solenopsyna znajduje się w jadzie mrówek ognistych, a mechanizm solenopsyny jest znacznie dokładniej zbadany. Oczekuje się, że mechanizmy zarówno euglenoficyny, jak i solenopsyny będą podobne.
Badania nad solenopsyną i jej mechanizmem działania są pierwszymi świetnymi wskazówkami dotyczącymi mechanizmu działania euglenoficyny. Badania in vitro wykazały, że solenopsyna ma działanie hamujące na PI3K/AKT, które są częścią szlaku mTOR w komórkach ssaków. Szlak ten jest wykorzystywany w kilku procesach komórkowych, takich jak wzrost komórek, proliferacja komórek, przeżycie komórki, synteza białek, ruchliwość komórek i autofagia.
Najnowsze badania wykazały, że euglenoficyna ma ogromny potencjał przeciwnowotworowy. Może to być spowodowane hamowaniem szlaku mTOR, ponieważ wiadomo, że szlak mTOR może mieć znaczący wpływ na stymulację komórek nowotworowych, gdy jest nadmiernie aktywowany. Wiadomo, że solenopsyna i euglenoficyna są zdolne do hamowania białka Pi3K. Pi3K aktywuje AKT poprzez fosforylację, co ma szereg dalszych efektów. Aktywuje szlak mTOR, bierze udział w regulacji metabolicznej oraz reguluje działanie inhibitorów cyklu komórkowego. Umożliwia proliferację i zmniejsza apoptozę. Jest nadaktywny w wielu rodzajach raka. Jednak ta ścieżka jest niezbędna do promowania wzrostu i różnicowania dorosłych (często nerwowych) komórek macierzystych.
Eksperymenty wykazały, że euglenoficyna ma również działanie przeciwangiogenetyczne. Euglenoficyna może hamować VEGF (czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego), a tym samym zapobiegać powstawaniu nowych żył dostarczających tlen i składniki odżywcze rosnącym nowotworom. Kiedy guzy zaczynają rosnąć, potrzebują dodatkowego tlenu i składników odżywczych. Odcinając ich dopływ, można zapobiegać nowotworom, zanim będą mogły rosnąć i rozprzestrzeniać się na inne części ciała.
Cabang i wsp. (2017) donieśli, że antyproliferacyjne działanie euglenoficyny jest indukowane przez jej zdolność do zatrzymania cyklu komórkowego G1 komórek. Zatrzymanie cyklu komórkowego ma miejsce, gdy komórka w cyklu komórkowym jest sprawdzana pod kątem błędów i zostaje wykryta pomyłka. Komórki muszą się doskonale duplikować, jeśli tak nie jest, cykl komórkowy zostaje wstrzymany, a komórka się nie duplikuje. Ma to na celu zapobieganie wzrostowi uszkodzonych komórek u zdrowej osoby.