Mikroprzepływy oparte na kroplach
Mikroprzepływy oparte na kroplach manipulują dyskretnymi objętościami płynów w niemieszających się fazach z niską liczbą Reynoldsa i reżimami przepływu laminarnego . Zainteresowanie układami mikroprzepływowymi opartymi na kroplach znacznie wzrosło w ostatnich dziesięcioleciach. Mikrokrople umożliwiają wygodną obsługę miniaturowych objętości (od μl do fl) płynów, zapewniają lepsze mieszanie, kapsułkowanie, sortowanie, wykrywanie i nadają się do eksperymentów o dużej przepustowości. Dwie niemieszające się fazy stosowane w systemach opartych na kroplach są określane jako faza ciągła (ośrodek, w którym przepływają kropelki) i faza rozproszona (faza kropelkowa).
Metody tworzenia kropel
Aby doszło do powstania kropel, muszą być użyte dwie niemieszające się fazy, określane jako faza ciągła (ośrodek, w którym powstają kropelki) i faza rozproszona (faza kropelkowa). Wielkość generowanych kropel jest kontrolowana głównie przez stosunek prędkości przepływu fazy ciągłej i fazy rozproszonej, napięcie międzyfazowe między dwiema fazami oraz geometrię kanałów wykorzystywanych do wytwarzania kropel. Kropelki mogą powstawać zarówno biernie, jak i aktywnie. Aktywne tworzenie kropel (elektryczne, magnetyczne, odśrodkowe) często wykorzystuje podobne urządzenia do tworzenia pasywnego, ale wymaga zewnętrznego wkładu energii do manipulacji kroplami. Pasywne tworzenie kropel jest bardziej powszechne niż aktywne, ponieważ daje podobne wyniki przy prostszych konstrukcjach urządzeń. Ogólnie rzecz biorąc, trzy rodzaje geometrii mikroprzepływów są wykorzystywane do pasywnego generowania kropel: (i) przepływ krzyżowy, (ii) skupienie przepływu i (iii) współprzepływ. Mikroprzepływy oparte na kroplach często działają przy niskich liczbach Reynoldsa, aby zapewnić przepływ laminarny w systemie. Wielkość kropli jest często określana ilościowo za pomocą współczynnika zmienności (CV) jako opisu odchylenia standardowego od średniej wielkości kropli. Każda z wymienionych metod zapewnia sposób generowania kropelek mikroprzepływowych w kontrolowany i przestrajalny sposób z odpowiednią manipulacją zmienną.
Tworzenie kropel o przepływie krzyżowym
Przepływ krzyżowy to pasywna metoda formowania, w której faza ciągła i wodna biegną pod kątem względem siebie. Najczęściej kanały są prostopadłe w złączu w kształcie litery T z fazą rozproszoną przecinającą fazę ciągłą; możliwe są również inne konfiguracje, takie jak złącze Y. Faza rozproszona rozciąga się do fazy ciągłej i jest rozciągana, aż siły ścinające oderwą kropelkę. W trójniku wielkość kropel i szybkość tworzenia się kropli są określane przez stosunek natężenia przepływu i liczbę kapilar . Liczba kapilar dotyczy lepkości fazy ciągłej, prędkości powierzchniowej fazy ciągłej i napięcia międzyfazowego. Zazwyczaj szybkość przepływu fazy rozproszonej jest mniejsza niż prędkość przepływu ciągłego. Formowanie trójników można dodatkowo zastosować, dodając dodatkowe kanały, tworząc dwa trójniki w jednym miejscu. Dodając kanały, można dodać różne fazy rozproszone w tym samym punkcie, aby utworzyć naprzemienne kropelki o różnych składach. Wielkość kropli, zwykle powyżej 10 μm, jest ograniczona wymiarami kanału i często wytwarza krople o CV poniżej 2% z częstotliwością do 7 kHz [4] .
Tworzenie się kropel skupiających przepływ
Skupianie przepływu jest zwykle pasywną metodą formowania, która polega na przepływie fazy rozproszonej w celu napotkania fazy ciągłej, zwykle pod kątem (strumienie nierównoległe), a następnie poddaniu ograniczeniu, które tworzy kropelkę. To ograniczenie polega na ogół na zwężeniu kanału w celu utworzenia kropli poprzez symetryczne ścinanie, po którym następuje kanał o równej lub większej szerokości. Podobnie jak w przypadku przepływu krzyżowego, natężenie przepływu fazy ciągłej jest zwykle większe niż natężenie przepływu fazy rozproszonej. Zmniejszenie przepływu fazy ciągłej może zwiększyć rozmiar kropelek. Aktywną metodą może być również ogniskowanie przepływu, w którym punkt ograniczający można regulować za pomocą pneumatycznych komór bocznych sterowanych sprężonym powietrzem. Ruchome komory działają w celu zaciśnięcia przepływu, deformując strumień i tworząc kroplę o zmiennej częstotliwości napędzania. Rozmiar kropli wynosi zwykle około kilkuset nanometrów przy CV poniżej 3% i częstotliwości od kilkuset Hz do dziesiątek kHz.
Współbieżne tworzenie kropel
Współprzepływ to pasywna metoda tworzenia kropelek, w której kanał fazy rozproszonej jest zamknięty wewnątrz kanału fazy ciągłej. Na końcu kanału fazy rozproszonej płyn jest rozciągany, aż oderwie się od sił ścinających i utworzy kropelki przez kapanie lub tryskanie. Kapanie występuje, gdy w systemie dominują siły kapilarne i w punkcie końcowym kanału tworzą się kropelki. Jetting następuje poprzez poszerzenie lub rozciągnięcie, gdy faza ciągła porusza się wolniej, tworząc strumień z otworu kanału fazy rozproszonej. W reżimie rozszerzania faza rozproszona porusza się szybciej niż faza ciągła, powodując spowolnienie fazy rozproszonej, rozszerzając kroplę i zwiększając średnicę. W reżimie rozciągania dominuje lepki opór, powodując zwężenie strumienia, tworząc mniejszą kroplę. Wpływ natężenia przepływu fazy ciągłej na wielkość kropel zależy od tego, czy system znajduje się w trybie rozciągania, czy rozszerzania, dlatego do przewidywania wielkości kropel należy zastosować różne równania. Rozmiar kropelek wynosi zwykle około kilkuset nanometrów przy CV poniżej 5% i częstotliwości do dziesiątek kHz.
Manipulacja kroplami
Korzyści płynące z mikroprzepływów można zwiększyć do wyższej przepustowości przy użyciu większych kanałów, aby umożliwić przejście większej liczby kropelek lub poprzez zwiększenie rozmiaru kropelek. Wielkość kropel można dostosować, dostosowując szybkość przepływu fazy ciągłej i rozproszonej, ale wielkość kropelek jest ograniczona koniecznością utrzymania stężenia, odległości między analitami i stabilności mikrokropelek. W związku z tym zwiększony rozmiar kanału staje się atrakcyjny ze względu na możliwość tworzenia i transportu dużej liczby kropelek, chociaż problemem staje się dyspersja i stabilność kropelek. Na koniec konieczne jest dokładne wymieszanie kropelek w celu odsłonięcia jak największej liczby odczynników, aby zapewnić reakcję maksymalnej ilości materiałów wyjściowych. Można to osiągnąć za pomocą wietrznego kanału, aby ułatwić niestabilny przepływ laminarny w kropelkach.
Środki powierzchniowo czynne w mikrofluidyce opartej na kropelkach
Środki powierzchniowo czynne odgrywają ważną rolę w mikroprzepływach opartych na kropelkach. Głównym celem stosowania środka powierzchniowo czynnego jest zmniejszenie napięcia międzyfazowego między fazą rozproszoną (faza kropelkowa, zwykle wodna) a fazą ciągłą (ciecz nośna, zwykle olej) poprzez adsorpcję na powierzchniach międzyfazowych i zapobieganie koalescencji kropelek , a tym samym stabilizację kropelki w stabilnym stanie emulsji , co pozwala na dłuższe przechowywanie w liniach opóźniających, zbiornikach lub fiolkach. Bez użycia środków powierzchniowo czynnych niestabilne emulsje ostatecznie przekształcą się w oddzielne fazy, aby zmniejszyć ogólną energię układu. Chemia powierzchni nie może być ignorowana w mikroprzepływach, ponieważ napięcie międzyfazowe staje się głównym czynnikiem wśród kropelek w mikroskali. Linas Mazutis i Andrew D. Griffiths przedstawili metodę wykorzystującą środki powierzchniowo czynne do uzyskania selektywnej i wysoce kontrolowanej koalescencji bez zewnętrznej manipulacji. Manipulują czasem kontaktu i pokryciem międzyfazowym środkiem powierzchniowo czynnym pary kropel, aby kontrolować syntezę kropel. Im większa różnica procentowa pokrycia międzyfazowego środka powierzchniowo czynnego między dwiema kropelkami, tym mniej prawdopodobne jest wystąpienie koalescencji. Ta metoda pozwoliła naukowcom dodawać odczynniki do kropelek w inny sposób i dalej badać proces emulgowania.
Mikrofluidyka jest szeroko stosowana w eksperymentach biochemicznych, dlatego ważne jest, aby środki powierzchniowo czynne były biokompatybilne podczas pracy z żywymi komórkami i analiz o wysokiej przepustowości. Środki powierzchniowo czynne stosowane w urządzeniach do badania żywych komórek nie powinny zakłócać reakcji biochemicznych ani funkcji komórkowych. Olej węglowodorowy zwykle nie jest używany w badaniach mikroprzepływów komórkowych, ponieważ nie jest kompatybilny z komórkami i uszkadza żywotność komórek. Olej węglowodorowy ekstrahuje również cząsteczki organiczne z fazy wodnej. Jednak fluorosurfaktanty z fluorowanymi ogonami są stosowane jako kompatybilny emulgator kropelek, który stabilizuje kropelki zawierające komórki w środku bez uszkadzania lub zmiany komórek. Fluorosurfaktanty są rozpuszczalne w oleju fluorowanym (faza ciągła), ale nierozpuszczalne w fazie wodnej, co powoduje zmniejszenie napięcia międzyfazowego woda-fluorowa. Na przykład trójblokowy kopolimerowy środek powierzchniowo czynny zawierający dwa perfluoropolieterowe (PFPE) i grupę blokową glikolu polietylenowego (PEG) jest fluorosurfaktantem o dużej biokompatybilności i doskonałej stabilności kropli wobec koalescencji. Innym przykładem są fluorowane liniowe poliglicerole, które mogą być dalej funkcjonalizowane na ich dostosowanych łańcuchach bocznych i są bardziej konfigurowalne w porównaniu z kopolimerem na bazie PEG. Surfaktanty można kupić od wielu firm chemicznych, takich jak RainDance Technologies (obecnie przez BioRad) i Miller-Stephenson.
Względy fizyczne
Po dodaniu środków powierzchniowo czynnych lub soli nieorganicznych do układu mikroprzepływowego opartego na kropelkach, napięcie międzyfazowe poszczególnych kropelek zmienia się w układzie mikroprzepływowym. Te elementy rozdzielające pozwalają na wykorzystanie kropelek jako mikroreaktorów dla różnych mechanizmów proceduralnych. W celu opisania zależności między napięciem międzyfazowym (), stężeniem zdysocjowanych środków powierzchniowo czynnych/sol w objętości kropli ( C ), temperaturą ( T ), stałą Boltzmanna ( k B ) i stężeniem zdysocjowanych środków powierzchniowo czynnych/sol na granicy faz (Γ), utworzono izotermę adsorpcji Gibbsa , uproszczoną sekcję podkreślającą istotne informacje wyświetlane po prawej stronie.
Ta izoterma potwierdza pogląd, że podczas gdy stężenie soli nieorganicznych wzrasta, sole są wyczerpywane z powierzchni międzyfazowej kropelek (Γ<0), a napięcie międzyfazowe kropelek wzrasta. Kontrastuje to z surfaktantami, które adsorbują na granicy faz (Γ>0) i niższym napięciem międzyfazowym . Przy niskich stężeniach środka powierzchniowo czynnego napięcie powierzchniowe zmniejsza się zgodnie z izotermą adsorpcji Gibbsa, aż do osiągnięcia pewnego stężenia, znanego jako krytyczne stężenie miceli (CMC), kiedy micele zaczynają się tworzyć. Po osiągnięciu CMC stężenie rozpuszczonego środka powierzchniowo czynnego osiąga maksimum, przy którym monomery środka powierzchniowo czynnego będą agregować, tworząc micele o wielkości nanometra. Ze względu na ten potencjał tworzenia miceli, podczas analizy adsorpcji środków powierzchniowo czynnych na granicy faz kropelki można zastosować trzy etapy. Po pierwsze, cząsteczki środka powierzchniowo czynnego adsorbują się między warstwą powierzchniową a warstwą podpowierzchniową. Po drugie, cząsteczki wymieniają się między powierzchnią a roztworem masowym. Po trzecie, micele rozluźniają się, co jest spowodowane złamaniem równowagi między wolnymi cząsteczkami a micelami.
Cząsteczki tworzące każdą micelę są zorganizowane w zależności od roztworu, w którym są zawieszone, przy czym bardziej rozpuszczalne części stykają się z roztworem, a mniej rozpuszczalne części cząsteczki stykają się ze sobą. Stwierdzono, że w zależności od stosunku objętości główek polarnych i ogona niepolarnego różne środki powierzchniowo czynne tworzą większe agregaty, puste w środku, dwuwarstwowe struktury zwane pęcherzykami . Godnym uwagi środkiem powierzchniowo czynnym, który tworzy pęcherzyki, jest AOT (sól sodowa sulfobursztynianu dioktylu). Te micele i pęcherzyki są stosunkowo nowymi odkryciami; zostały one jednak wykorzystane do transportu środków w układach mikroprzepływowych, ujawniając przyszłe zastosowania transportu mikroprzepływowego.
Dodanie odczynnika
Reakcje w mikroskali przeprowadzane w aplikacjach opartych na kroplach oszczędzają odczynniki i skracają czas reakcji, a wszystko to z szybkością kiloherców. Dodawanie odczynników do mikroreaktorów kropelkowych było przedmiotem badań ze względu na trudność w uzyskaniu powtarzalnych dodatków z szybkością kiloherców bez zanieczyszczenia kropla do kropli.
Współprzepływ odczynnika przed utworzeniem kropel
Odczynniki można dodawać w czasie formowania się kropelek poprzez geometrię „współprzepływu”. Strumienie odczynników pompowane są oddzielnymi kanałami i łączą się na styku z kanałem zawierającym fazę ciągłą, która ścina i tworzy kropelki zawierające oba odczynniki. Zmieniając prędkości przepływu w kanałach odczynników, można kontrolować proporcje odczynników w kropli.
Fuzja kropelkowa
Fuzję kropelek o różnej zawartości można również wykorzystać do dodania odczynnika. Elektrokoalescencja łączy pary kropelek poprzez zastosowanie pola elektrycznego w celu tymczasowej destabilizacji interfejsu kropelka-kropelka w celu uzyskania powtarzalnej fuzji kropelek w emulsjach stabilizowanych środkiem powierzchniowo czynnym. Elektrokoalescencja wymaga kontaktu kropelek (które normalnie są oddzielone fazą ciągłą). Manipulując wielkością kropelek w oddzielnych strumieniach, zróżnicowany przepływ wielkości kropelek może doprowadzić do kontaktu kropelek przed połączeniem.
Inną metodą ułatwiania fuzji kropelek jest pęseta akustyczna. Podczas gdy kropelki płyną w kanałach mikroprzepływowych, można je unieruchomić za pomocą pęsety akustycznej na podstawie powierzchniowych fal akustycznych . Gdy kropelka zostanie przytrzymana pęsetą akustyczną, kolejne kropelki zderzają się z nią i następuje fuzja.
Wstrzykiwanie odczynników do istniejących kropel
Metody współprzepływu odczynników i fuzji kropelek są powiązane ze zdarzeniami tworzenia kropelek, które nie są elastyczne w dalszej części procesu. Aby oddzielić dodawanie odczynnika od tworzenia kropelek, wykorzystuje się układ, w którym strumień odczynników przepływa przez kanał prostopadły do strumienia kropelek. Kropelka wtrysku jest następnie łączona z korkiem, gdy przechodzi przez kanał. Objętość odczynnika jest kontrolowana przez szybkość przepływu prostopadłego kanału odczynnika.
Wczesnym wyzwaniem dla takich systemów jest to, że łączenie kropel odczynnika nie było powtarzalne dla stabilnych emulsji. Dostosowując użycie uruchomionego pola elektrycznego do tej geometrii, Abate i in. uzyskano subpikolitrową kontrolę wstrzykiwania odczynnika. To podejście, zwane pikoiniekcją, kontroluje objętość wtrysku poprzez ciśnienie strumienia odczynnika i prędkość kropel. Dalsze prace nad tą metodą miały na celu zmniejszenie wahań ciśnienia, które utrudniają powtarzalne iniekcje.
Wtrysk płynu wodnego pod ciśnieniem następuje, gdy elektrody są aktywowane, tworząc pole elektryczne, które destabilizuje interfejs płyn wodny/olej, uruchamiając wtrysk. Kluczowe zalety pikoinjekcji obejmują niski niezamierzony transfer materiału między kropelkami i utrzymanie kompartmentalizacji kropelek poprzez wtrysk, jednak elektrody są często wytwarzane przy użyciu lutu metalicznego, co może skomplikować konstrukcję urządzenia mikroprzepływowego ze względu na wydłużony czas produkcji w wyniku bardziej skomplikowanej konstrukcji . Alternatywna metoda pikoiniekcji polega na wykorzystaniu odczynnika wstrzykującego jako przewodnika pola elektrycznego, w którym napięcie przyłożone do płynu stymuluje wstrzyknięcie. Taka metoda pozwala również na większą kontrolę wtrysku, ponieważ przyłożone napięcie odpowiada objętości wtryskiwanego płynu reagentowego.
Zanieczyszczenie kropla do kropli jest wyzwaniem dla wielu metod iniekcji. Aby temu zaradzić, Doonan i in. opracowali wielofunkcyjny kanał K, który przepływa strumienie odczynników w kierunku przeciwnym do ścieżki strumienia kropel. Wykorzystując interfejs między dwoma kanałami, iniekcja jest podobna do pikoiniekcji, ale wszelkie dwustronne zanieczyszczenia są wypłukiwane przez ciągły przepływ odczynnika. Unika się zanieczyszczenia kosztem potencjalnego marnowania cennego odczynnika.
Inkubacja kropelek
Aby mikroprzepływy kropelkowe stały się realną techniką przeprowadzania reakcji chemicznych lub pracy z żywymi komórkami w mikroskali, konieczne jest wdrożenie metod pozwalających na inkubację kropel. Reakcje chemiczne często wymagają czasu, a żywe komórki podobnie potrzebują czasu, aby rosnąć, rozmnażać się i przeprowadzać procesy metaboliczne . Inkubację kropel można przeprowadzić w samym urządzeniu (on-chip) lub na zewnątrz (off-chip), w zależności od parametrów systemu. Inkubacja poza chipem jest przydatna w przypadku inkubacji trwającej jeden dzień lub dłużej lub w przypadku inkubacji milionów kropelek jednocześnie. Inkubacja na chipie umożliwia integrację manipulacji kroplami i etapów wykrywania w jednym urządzeniu.
Inkubacja poza chipem
Kropelki zawierające komórki można przechowywać poza chipem w rurkach PTFE przez kilka dni, zachowując żywotność komórek i umożliwiając ponowne wstrzyknięcie do innego urządzenia w celu analizy. Donoszono o parowaniu płynów wodnych i olejowych podczas przechowywania kropelek w rurkach PTFE, więc do przechowywania dłuższego niż kilka dni stosuje się również szklane kapilary. Wreszcie, po utworzeniu w urządzeniu mikroprzepływowym, kropelki mogą być również prowadzone przez system kapilar i rurek prowadzących do strzykawki. Kropelki można inkubować w strzykawce, a następnie wstrzykiwać bezpośrednio na inny chip w celu dalszej manipulacji lub wykrywania i analizy.
Inkubacja na chipie
Linie opóźniające służą do inkubacji kropelek na chipie. Po utworzeniu kropelki można wprowadzić do wężowego kanału o długości do metra lub więcej. Zwiększenie głębokości i szerokości kanału linii opóźniającej (w porównaniu z kanałami używanymi do formowania i transportu kropelek) umożliwia wydłużenie czasu inkubacji przy jednoczesnym zminimalizowaniu przeciwciśnienia w kanale . Ze względu na większy rozmiar kanału kropelki wypełniają kanał linii opóźniającej i inkubują w czasie potrzebnym kropelkom na przejście przez ten kanał.
Linie opóźniające zostały pierwotnie zaprojektowane do inkubacji kropelek zawierających mieszaniny reakcji chemicznych i były w stanie osiągnąć czasy opóźnienia do jednej godziny. Urządzenia te wykorzystują kanały linii opóźniającej o długości kilkudziesięciu centymetrów. Zwiększenie całkowitej długości kanałów linii opóźniającej do jednego lub więcej metrów umożliwiło czasy inkubacji wynoszące 12 lub więcej godzin. Wykazano, że linie opóźniające zachowują stabilność kropelek do 3 dni, a żywotność komórek wykazano przy użyciu linii opóźniających na chipie do 12 godzin. Przed opracowaniem linii opóźniających inkubację na chipie prowadzono poprzez kierowanie kropel do dużych zbiorników (kilka milimetrów długości i szerokości), co zapewnia dużą pojemność magazynową oraz mniejszą złożoność konstrukcji i działania urządzenia, jeśli wymagana jest precyzyjna kontrola czasu kropelek nie wymagane.
Jeśli ważne jest równomierne rozłożenie czasów inkubacji kropelek, kanał linii opóźniającej może zawierać regularnie rozmieszczone przewężenia. Kropelki przepływające przez kanał o jednakowej średnicy poruszają się z różnymi prędkościami w zależności od ich położenia promieniowego; kropelki bliżej środka kanału poruszają się szybciej niż te blisko krawędzi. Zawężając szerokość kanału do ułamka jego pierwotnego rozmiaru, kropelki o wyższych prędkościach są zmuszone do równoważenia się z wolniej poruszającymi się kropelkami, ponieważ zwężenie pozwala na przejście mniejszej liczby kropel na raz. Inna manipulacja geometrią kanału linii opóźniającej polega na wprowadzeniu zwojów trajektorii kropelek. Zwiększa to stopień, w jakim wszelkie reagenty zawarte w kropelkach są mieszane poprzez chaotyczną adwekcję . W przypadku systemów wymagających inkubacji od 100 do 1000 kropel, w kanale linii opóźniającej można wytworzyć pułapki, które przechowują kropelki oddzielnie od siebie. Zapewnia to dokładniejszą kontrolę i monitorowanie poszczególnych kropel.
Kropelki magnetyczne
Metoda mikromagnetofluidyczna polega na sterowaniu płynami magnetycznymi za pomocą przyłożonego pola magnetycznego na platformie mikroprzepływowej, oferując bezprzewodową i programowalną kontrolę kropelek magnetycznych. W związku z tym siła magnetyczna może być również wykorzystywana do wykonywania różnych operacji logicznych, oprócz siły hydrodynamicznej i siły napięcia powierzchniowego. Siła pola magnetycznego, rodzaj pola magnetycznego (gradient, jednorodny lub rotacyjny), podatność magnetyczna, napięcie międzyfazowe , natężenia przepływu i stosunki natężenia przepływu określają kontrolę kropel na platformie mikromagnetofluidycznej.
Kropelki magnetyczne, w kontekście mikroprzepływów opartych na kroplach, to kropelki wielkości mikrolitrów, które albo składają się z ferrofluidów, albo zawierają jakiś składnik magnetyczny, który umożliwia manipulację za pomocą przyłożonego pola magnetycznego. Ferrofluidy to jednorodne mieszaniny koloidalnych roztworów nanocząstek magnetycznych w ciekłym nośniku. Dwa zastosowania kropelek magnetycznych to kontrola i manipulacja kropelkami mikroprzepływowymi w mikrośrodowisku oraz wytwarzanie, transport i wykorzystanie konstrukcji nanomateriałów w mikrokroplach. Manipulowanie kroplami magnetycznymi może być wykorzystywane do wykonywania zadań, takich jak układanie kropelek w uporządkowany układ do zastosowań w badaniach hodowli komórkowych, podczas gdy wykorzystanie kropelek magnetycznych do wytwarzania nanostruktur może być wykorzystywane w zastosowaniach związanych z dostarczaniem leków.
Kropelki magnetyczne w układach nietradycyjnych
W tradycyjnych układach mikroprzepływowych opartych na kropelkach, to znaczy kropli w kanale, który zawiera niemieszający się olej, który oddziela kropelki, ruch kropelek uzyskuje się poprzez różnice ciśnienia lub napięcia powierzchniowego. W nietradycyjnych układach mikroprzepływowych opartych na kropelkach, takich jak te tutaj, do manipulowania kropelkami potrzebne są inne mechanizmy kontroli. Zastosowanie pola magnetycznego do układu mikroprzepływów zawierającego kropelki magnetyczne umożliwia łatwe sortowanie i układanie kropelek w użyteczne wzory i konfiguracje. Tego typu manipulacje można osiągnąć poprzez statyczne lub dynamiczne zastosowanie pola magnetycznego, co pozwala na wysoki stopień kontroli nad kroplami magnetycznymi. Charakterystyka stopnia kontroli nad kroplami magnetycznymi obejmuje pomiary podatności magnetycznej ferrofluidu, pomiar zmiany kropelki na powierzchni międzyfazowej podłoża pod wpływem przyłożonego pola magnetycznego oraz pomiar „kąta rozwarcia” lub kąt, pod jakim kropla poruszałaby się w obecności pola magnetycznego, gdy powierzchnia była pochylona. Interakcjami między kroplą wody a powierzchnią można manipulować, dostosowując strukturę samego układu mikroprzepływowego, przykładając pole magnetyczne do domieszkowanego żelazem poli[dimetylosiloksanu] (PDMS), powszechnego materiału do urządzeń mikroprzepływowych.
W innych systemach uważanych za nietradycyjne, oparte na kroplach układy mikroprzepływowe, mikrokrople magnetyczne mogą być łatwym sposobem wytwarzania i kontroli mikro- i nanomateriałów, czasami nazywanych „robotami”. Te nanostruktury są utworzone z nanocząstek magnetycznych w mikrokropelkach, które zostały zmanipulowane w określone struktury za pomocą przyłożonego pola magnetycznego. Mikrohelisy to wielofunkcyjne zastosowanie tej technologii. Monodyspersyjne kropelki zawierające nanocząsteczki magnetyczne są generowane i poddawane działaniu pola magnetycznego, które organizuje nanocząstki w spiralny szablon, który jest wytwarzany na miejscu poprzez fotoindukowaną polimeryzację. Wykazano, że te mikrohelisy skutecznie oczyszczają kanały, które zostały zablokowane półstałymi kompozytami tłuszczów, olejów i białek, takimi jak te znajdujące się w tętnicach. Wykazano, że mikrohelisy i skupiska mikrocząstek w kropelkach magnetycznych są środkami transportu dla małych (o średnicy 500 µm ) mikrocząstek, wykazując również zastosowania w dostarczaniu leków. Niesferyczne mikrostruktury zostały również wytworzone przy użyciu mikrofluidyki magnetycznej, demonstrując dostępną kontrolę minutową. Wśród niesferycznych mikrostruktur, które miały zostać wytworzone, znalazły się mikrokapsułki z tlenku grafenu, które można było zasysać i ponownie napełniać za pomocą mikropipety, wykazując jednocześnie właściwości fotoreagujące i magnetoresponsywne. Mikrokapsułki reagujące na bodźce magnetyczne i foto, takie jak te zbudowane z tlenku grafenu, są przydatne w zastosowaniach biomedycznych, które wymagają in vivo bezkontaktowej manipulacji strukturami komórkowymi, takimi jak komórki macierzyste.
Sortowanie kropelek
Sortowanie kropelek w mikroprzepływach jest ważną techniką, pozwalającą na rozróżnienie na podstawie czynników, począwszy od wielkości kropelek, a skończywszy na substancjach chemicznych oznaczonych znacznikami fluorescencyjnymi w kropli, wynikającymi z pracy wykonanej w celu sortowania komórek w cytometrii przepływowej . W dziedzinie sortowania kropelkowego istnieją dwa główne typy, sortowanie masowe, które wykorzystuje metody aktywne lub pasywne, oraz sortowanie precyzyjne, które opiera się głównie na metodach aktywnych. Sortowanie zbiorcze stosuje się do próbek o dużej liczbie kropelek (> 2000 s -1 ), które można sortować na podstawie wewnętrznych właściwości kropelek (takich jak lepkość, gęstość itp.) bez sprawdzania każdej kropli. Z drugiej strony precyzyjne sortowanie ma na celu oddzielenie kropelek spełniających określone kryteria, które są sprawdzane na każdej kropli.
Sortowanie pasywne odbywa się poprzez kontrolę projektu kanału mikroprzepływowego, co pozwala na dyskryminację na podstawie wielkości kropel. Sortowanie według wielkości opiera się na rozwidlających się połączeniach w kanale, które odwracają przepływ, co powoduje sortowanie kropel na podstawie ich interakcji z przekrojem poprzecznym tego przepływu, szybkości ścinania, która jest bezpośrednio związana z ich rozmiarem. Inne metody pasywne obejmują bezwładność i mikrofiltrację, z których każda ma związek z właściwościami fizycznymi, takimi jak bezwładność i gęstość kropli. Sortowanie aktywne wykorzystuje dodatkowe urządzenia dołączone do urządzenia mikroprzepływowego w celu zmiany ścieżki kropelki podczas przepływu poprzez kontrolowanie niektórych aspektów, w tym kontroli termicznej, magnetycznej, pneumatycznej, akustycznej, hydrodynamicznej i elektrycznej. Te kontrole są wykorzystywane do sortowania kropelek w odpowiedzi na wykrywanie pewnych sygnałów z kropelek, takich jak intensywność fluorescencji.
Precyzyjne metody sortowania wykorzystują te aktywne metody sortowania, podejmując najpierw decyzję (np. sygnał fluorescencji) o kropelkach, a następnie zmieniając ich przepływ za pomocą jednej z wyżej wymienionych metod. Opracowano technikę o nazwie Fluorescent Activated Droplet Sorting (FADS), która wykorzystuje aktywne sortowanie indukowane polem elektrycznym z detekcją fluorescencyjną do sortowania do 2000 kropelek na sekundę. Sposób opiera się, ale nie wyłącznie, na aktywności enzymatycznej podzielonych na przedziały komórek docelowych w celu aktywacji substratu fluorogennego w kropli. Po wykryciu fluoryzującej kropli włączane są dwie elektrody, które przykładają do kropli pole, które przesuwa jej kurs do kanału selekcyjnego, podczas gdy kropelki niefluorescencyjne przepływają przez główny kanał do odpadów. Inne metody wykorzystują inne kryteria selekcji, takie jak absorbancja kropelki, liczba zakapsułkowanych cząstek lub rozpoznawanie obrazu kształtów komórek. Sortowanie można przeprowadzić w celu poprawy czystości kapsułkowania, co jest ważnym czynnikiem przy pobieraniu próbki do dalszych eksperymentów.
Kluczowe aplikacje
Hodowlę komórkową
Jedną z kluczowych zalet mikroprzepływów opartych na kroplach jest możliwość wykorzystania kropelek jako inkubatorów dla pojedynczych komórek.
Urządzenia zdolne do generowania tysięcy kropelek na sekundę otwierają nowe sposoby charakteryzowania populacji komórek, nie tylko w oparciu o określony marker mierzony w określonym punkcie czasowym, ale także w oparciu o kinetyczne zachowanie komórek, takie jak wydzielanie białek, aktywność enzymatyczna lub proliferacja. Niedawno odkryto metodę generowania stacjonarnego układu mikroskopijnych kropelek do inkubacji pojedynczych komórek, która nie wymaga użycia środka powierzchniowo czynnego . [ potrzebne źródło ]
Hodowla komórkowa przy użyciu mikroprzepływów opartych na kroplach
Kropelkowe systemy mikroprzepływowe zapewniają platformę analityczną, która umożliwia izolację pojedynczych komórek lub grup komórek w kropelkach. To narzędzie zapewnia wysoką przepustowość w eksperymentach komórkowych, ponieważ systemy mikroprzepływowe oparte na kroplach mogą generować tysiące próbek (kropelek) na sekundę. W porównaniu z hodowlą komórkową na konwencjonalnych płytkach do mikromiareczkowania , mikrokrople o objętości od μL do pL zmniejszają zużycie odczynników i komórek. Ponadto zautomatyzowana obsługa i ciągłe przetwarzanie umożliwiają bardziej wydajne przeprowadzanie testów. Wyizolowane środowisko w zamkniętej kropli pomaga analizować populację każdej pojedynczej komórki. Eksperymenty z kulturami komórkowymi o wysokiej przepustowości, na przykład testowanie zachowania bakterii, znajdowanie rzadkich typów komórek, ukierunkowana ewolucja i badania przesiewowe komórek, są odpowiednie do stosowania technik mikroprzepływowych opartych na kropelkach.
Materiały, inkubacja i żywotność
Polidimetylosiloksan (PDMS) jest najczęściej stosowanym materiałem do wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych ze względu na niski koszt, łatwość prototypowania i dobrą przepuszczalność gazu. Wraz z perfluorowęglowodorowymi olejami nośnikowymi , które również zapewniają dobrą przepuszczalność gazów, stosowanymi jako faza ciągła w kropelkowym układzie mikroprzepływowym do hodowli komórkowych, niektóre badania wykazały, że żywotność komórek jest porównywalna z hodowlą w kolbach, na przykład komórek ssaków. Aby osiągnąć wymagany czas hodowli, można użyć zbiornika lub linii opóźniającej. Korzystanie ze zbiornika umożliwia hodowlę długoterminową od kilku godzin do kilku dni, podczas gdy linia opóźniająca nadaje się do hodowli krótkoterminowej trwającej kilka minut. Inkubacja jest możliwa zarówno na chipie (zbiornik połączony z układem mikroprzepływowym lub liniami opóźniającymi), jak i poza chipem (przewody PTFE izolowane układem mikroprzepływowym) po utworzeniu kropelek. Po inkubacji kropelki można ponownie wstrzyknąć do urządzenia mikroprzepływowego w celu analizy. Istnieją również specjalnie zaprojektowane systemy przechowywania kropel na chipie do bezpośredniej analizy, takie jak urządzenie „dropspot”, które przechowuje kropelki w kilku komorach macierzy i wykorzystuje skaner mikromacierzy do bezpośredniej analizy.
Wyzwania
Hodowla komórkowa przy użyciu mikroprzepływów opartych na kropelkach stworzyła wiele możliwości badawczych, które są niedostępne na konwencjonalnych platformach, ale także wiążą się z wieloma wyzwaniami. Niektóre wyzwania związane z hodowlą komórkową w mikroprzepływach opartych na kroplach są wspólne dla innych systemów hodowli mikroprzepływowej. Po pierwsze, należy ponownie ocenić zużycie składników odżywczych dla określonego układu mikroprzepływowego. Na przykład zużycie glukozy jest czasami zwiększone w układach mikroprzepływowych (w zależności od typu komórki). Obrót pożywki jest czasami szybszy niż w hodowli makroskopowej ze względu na zmniejszoną objętość hodowli, dlatego też objętość używanej pożywki musi być dostosowana w każdej linii komórkowej i urządzeniu. Po drugie, proliferacja i zachowanie komórek może się różnić w zależności od systemów mikroprzepływowych, decydującym czynnikiem jest powierzchnia hodowli do objętości pożywki, które różnią się w zależności od urządzenia. W jednym raporcie stwierdzono, że proliferacja w mikrokanałach była osłabiona; zwiększona suplementacja glukozy lub surowicy nie rozwiązała problemu w jego konkretnym przypadku. Po trzecie, regulacja pH musi być kontrolowana. PDMS jest bardziej przepuszczalny dla CO 2 niż dla O 2 lub N 2 , dlatego poziom rozpuszczonego gazu podczas inkubacji powinien być dostosowany do oczekiwanego pH.
Biologiczna charakterystyka makrocząsteczek
Krystalizacja białka
Urządzenia oparte na kroplach zostały również wykorzystane do zbadania warunków niezbędnych do krystalizacji białek.
PCR na kropelkach
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) od samego początku była kluczowym narzędziem w genomice i badaniach biologicznych, ponieważ znacznie przyspieszyła produkcję i analizę próbek DNA do szerokiego zakresu zastosowań. Postęp technologiczny PCR w skali mikrokropelkowej umożliwił skonstruowanie jednocząsteczkowego urządzenia PCR-on-a-chip. replikacja pojedynczej cząsteczki DNA , w tym to, co zachodzi w PCR mikrokropelkowym lub emulsyjnym, była trudniejsza niż PCR na większą skalę, dlatego zwykle stosowano znacznie wyższe stężenia składników. Jednak w pełni zoptymalizowane warunki zminimalizowały to przeciążenie, zapewniając, że pojedyncze cząsteczki mają odpowiednie stężenie składników replikacyjnych rozmieszczonych w całej komórce reakcyjnej. Mikroprzepływowy PCR bez kropelek również napotyka wyzwania związane z absorpcją odczynników w kanałach urządzenia, ale systemy oparte na kropelkach zmniejszają ten problem dzięki zmniejszonemu kontaktowi z kanałami.
Wykorzystując systemy woda w oleju, PCR kropelkowy działa poprzez łączenie składników, formowanie kropelek, łączenie kropelek, cykle termiczne, a następnie przetwarzanie wyników podobnie jak normalny PCR. Ta technika jest w stanie przeprowadzić ponad 2 miliony reakcji PCR, a także 100 000-krotny wzrost wykrywalności alleli typu dzikiego w porównaniu z allelami zmutowanymi . PCR oparty na kroplach znacznie zwiększa możliwości multipleksowania normalnego PCR – umożliwiając szybkie tworzenie bibliotek mutacji. Bez korekty replikacja DNA jest z natury nieco podatna na błędy, ale dzięki wprowadzeniu podatnych na błędy polimeraz , PCR oparty na kropelkach wykorzystuje wyższą niż normalnie wydajność mutacji, aby zbudować bibliotekę mutacji szybciej i wydajniej niż normalnie. To sprawia, że PCR oparty na kroplach jest bardziej atrakcyjny niż wolniejszy, tradycyjny PCR. W podobnym zastosowaniu opracowano wysoce multipleksowany PCR na mikrokropelkach, który umożliwia badanie przesiewowe dużej liczby sekwencji docelowych, umożliwiając zastosowania takie jak identyfikacja bakterii. PCR na chipie pozwala na multipleksowanie w nadmiarze 15 x 15, co oznacza, że wiele docelowych sekwencji DNA może być przetwarzanych na tym samym urządzeniu w tym samym czasie. To multipleksowanie było możliwe dzięki unieruchomionym starterów DNA umieszczonym w podstawie poszczególnych studzienek czipów.
Połączenie PCR na kropelkach z urządzeniami do polidimetylosiloksanu (PDMS) umożliwiło nowatorskie ulepszenia PCR na kropelkach, a także zaradzenie niektórym wcześniej istniejącym problemom z PCR na kropelkach, w tym dużej utracie cieczy w wyniku parowania. Metoda PCR na kropelkach jest bardzo wrażliwa na pęcherzyki powietrza, ponieważ powodują one różnice temperatur utrudniające replikację DNA, a jednocześnie usuwające odczynniki z komory replikacyjnej. Teraz PCR oparty na kroplach został przeprowadzony w urządzeniach PDMS w celu przeniesienia odczynników do kropelek przez warstwę PDMS w bardziej kontrolowany sposób, który lepiej utrzymuje postęp i stabilność replikacji niż tradycyjne zawory. Niedawne urządzenie PDMS do kropelkowej PCR pozwoliło na większą dokładność i amplifikację małych liczb kopii w porównaniu z tradycyjnymi ilościowymi eksperymentami PCR. Ta wyższa dokładność była spowodowana PDMS domieszkowanym środkiem powierzchniowo czynnym, a także konstrukcją urządzenia typu sandwich szkło-PDMS-szkło. Te właściwości urządzenia pozwoliły na bardziej usprawnione przygotowanie DNA i mniejsze parowanie wody podczas cykli PCR.
sekwencjonowanie DNA
sekwencjonowania DNA zastosowano wiele systemów mikroprzepływowych, w tym systemy oparte na kroplach .
Kierowana ewolucja
Ukierunkowana ewolucja enzymu to powtarzalny proces tworzenia losowych mutacji genetycznych, poszukiwania docelowego fenotypu i wybierania najbardziej odpornego wariantu ( wariantów) do dalszej modyfikacji. Zdolność ludzkości do wykorzystania ukierunkowanej ewolucji w celu optymalizacji enzymów do celów biotechnologicznych jest w dużej mierze ograniczona przez przepustowość narzędzi i metod przesiewowych oraz prostotę ich użycia. Ze względu na iteracyjny charakter ukierunkowanej ewolucji i konieczność posiadania dużych bibliotek, ukierunkowana ewolucja w makroskali może być kosztownym przedsięwzięciem. W związku z tym przeprowadzanie eksperymentów w mikroskali za pomocą mikroprzepływów opartych na kroplach stanowi znacznie tańszą alternatywę dla makroskopowych odpowiedników. Różne podejścia wyceniają ukierunkowaną ewolucję za pomocą mikroprzepływów kropelkowych poniżej 40 dolarów za przesiewanie biblioteki genów o wielkości 10 6 -10 7 , podczas gdy odpowiedni eksperyment w makroskali jest wyceniony na około 15 milionów dolarów. Dodatkowo, przy czasach przesiewania w zakresie od 300 do 2000 kropel sortowanych na sekundę, mikroprzepływy oparte na kropelkach zapewniają platformę do znacznie przyspieszonego przeszukiwania bibliotek, tak że biblioteki genów liczące 10 7 można dobrze posortować w ciągu jednego dnia. Kropelkowe urządzenia mikroprzepływowe sprawiają, że ukierunkowana ewolucja jest dostępna i opłacalna.
Opracowano wiele różnych podejść do budowy urządzeń mikroprzepływowych opartych na kroplach w celu ukierunkowanej ewolucji, aby mieć możliwość badania przesiewowego szerokiej gamy różnych białek, ścieżek i genomów. Jedna metoda podawania bibliotek do urządzenia mikroprzepływowego wykorzystuje kapsułkowanie pojedynczych komórek, w którym kropelki zawierają maksymalnie jedną komórkę. Pozwala to uniknąć mylących wyników, które mogłyby zostać wygenerowane przez posiadanie wielu komórek, aw konsekwencji wielu genotypów, w jednej kropli, przy jednoczesnej maksymalizacji efektywności wykorzystania zasobów. Metoda ta umożliwia wykrycie białek wydzielanych oraz białek znajdujących się na błonie komórkowej. Dodanie lizatu komórkowego , który rozbija błonę komórkową w taki sposób, że cząsteczki wewnątrzkomórkowe są swobodnie dostępne w kropelce, rozszerza możliwości metody enkapsulacji pojedynczej komórki do analizy białek wewnątrzkomórkowych. Bibliotekę można również sporządzić całkowicie in vitro (tj. nie w jej biologicznym/komórkowym kontekście) tak, że zawartość kropelki jest wyłącznie zmutowaną nicią DNA. System in vitro wymaga PCR i zastosowania systemów transkrypcji i translacji in vitro (IVTT) w celu wytworzenia pożądanego białka w kropli do analizy. Sortowanie kropelek w celu ukierunkowanej ewolucji odbywa się głównie za pomocą detekcji fluorescencyjnej (np. sortowanie kropelek aktywowane fluorescencją (FADS)), jednak niedawny rozwój metod sortowania opartych na absorbancji, znanych jako sortowanie kropel aktywowanych absorbancją (AADS), rozszerzył różnorodność substratów, które mogą podlegać ukierunkowanej ewolucji za pomocą urządzenia mikroprzepływowego opartego na kropelkach. Ostatnio możliwości sortowania rozszerzyły się nawet na wykrywanie NADPH i zostały wykorzystane do stworzenia oksydoreduktaz zależnych od NADP o wyższej aktywności . Ostatecznie potencjał różnych metod tworzenia i analizy kropelek w urządzeniach mikroprzepływowych opartych na kroplach z ukierunkowaną ewolucją pozwala na zmienność, która ułatwia dużą populację potencjalnych kandydatów do ukierunkowanej ewolucji.
Jako metoda inżynierii białek, ukierunkowana ewolucja ma wiele zastosowań w różnych dziedzinach, od opracowywania leków i szczepionek po syntezę żywności i chemikaliów. Opracowano urządzenie mikroprzepływowe w celu zidentyfikowania ulepszonych gospodarzy produkujących enzymy (tj. fabryk komórek), które można zastosować przemysłowo w różnych dziedzinach. Sztuczna aldolaza została dodatkowo wzmocniona 30-krotnie za pomocą mikroprzepływów opartych na kroplach, dzięki czemu jej aktywność przypominała naturalnie występujące białka. Niedawno tworzenie funkcjonalnych oksydaz zostało umożliwione przez nowatorskie urządzenie mikroprzepływowe stworzone przez Debona i in. Podejście mikroprzepływowe oparte na kropelkach do ukierunkowanej ewolucji ma ogromny potencjał w zakresie rozwoju niezliczonych nowych białek.
Najnowsze postępy
Od początku XXI wieku postępy w mikroprzepływach opartych na kroplach sprawiły, że jest to potężna technika prowadzenia ukierunkowanych kampanii ewolucyjnych. Po wczesnych osiągnięciach w masowej produkcji pojedynczych emulsji (SE) (np. kropelek „woda w oleju”) i podwójnych emulsji (DE) (np. kropelek „woda w oleju w wodzie”) nastąpiły innowacje w tworzenie i sortowanie SE i DE na chipie, co pozwala na większą łatwość i przepustowość ukierunkowanych eksperymentów ewolucyjnych na chipach mikroprzepływowych.
Istotnym elementem ukierunkowanej ewolucji jest utrzymanie powiązań między genotypami enzymatycznymi a fenotypami. Możliwość tworzenia DE na chipie, a następnie sortowania za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją ( FACS ) posunęła dziedzinę naprzód. W 2013 roku Yan i in. pokazał użycie FACS do sortowania DE. W 2014 roku Zinchenko i in. opublikował system do formułowania monodyspersyjnych DE oraz do ich sortowania i analizy ilościowej za pomocą dostępnego w handlu cytometru przepływowego. Autorzy zademonstrowali moc swojego systemu, wzbogacając aktywną arylosulfatazę typu dzikiego z populacji 0,1% i 0,01% aktywnych komórek odpowiednio od 800 do 2500 razy. W 2016 roku Larsen i in. opracowali oparty na fluorescencji system sortowania optycznego do monitorowania aktywności polimeraz wewnątrz urządzenia mikroprzepływowego. Korzystając ze swojego systemu, Larsen i współpracownicy wykazali około 1200-krotne wzbogacenie zmodyfikowanej polimerazy. Po jednej rundzie selekcji polimerazy kwasu alfa-L-treofuranozylonukleinowego (TNA) wykazali około 14-krotną poprawę aktywności i >99% poprawne rozmieszczenie reszt w rosnącym polipeptydzie. W 2017 roku SS Terekhov i in. opracowali monodyspersyjne mikroprzepływowe sortowanie w podwójnej emulsji typu woda w oleju w wodzie (MDE), które połączyli z FACS, a następnie chromatografią cieczową ze spektrometrią mas ( LC-MS ) i sekwencjonowaniem nowej generacji ( NGS ). Autorzy wykazali wysoką czułość sortowania aktywnych enzymatycznie komórek drożdży od komórek nieaktywnych przy użyciu fluorescencji. Ponadto wykazali zdolność swojego systemu MDE-FACS do badania interakcji między komórkami docelowymi i efektorowymi w kropelkach bez ingerencji ze strony innych komórek drożdży i bakterii.
Zamiast opracowywać nowe platformy, niektóre grupy skupiły się na optymalizacji istniejących metod, narzędzi i platform, aby uprościć i poprawić łatwość ich użytkowania przez osoby niebędące ekspertami. W 2017 roku Sukovitch i in. stworzył system do produkcji monodyspersyjnych lub mniej więcej równych rozmiarów DE poprzez wyeliminowanie procesu powlekania wymaganego dla chipów DE. Różne grupy zmieniły typy i stężenia środków powierzchniowo czynnych , aby uprościć dostarczanie odczynników w SE i DE. W 2018 roku Ma i in. przedstawił dwukanałowy mikroprzepływowy system przesiewania kropel (DMDS). System wykorzystuje znaczniki fluorogenne do jednoczesnego sortowania SE według dwóch różnych właściwości docelowego enzymu. Korzystając z DMDS, Ma i współpracownicy kierowali ewolucją wysoce enancjoselektywnej esterazy, wykorzystując wiele właściwości enzymatycznych. W 2020 roku Brower i in. zademonstrował sortowanie DE i izolację na chipie, a następnie FACS, co pozwala na wysoką przepustowość sortowania zamkniętych komórek ssaków, z których można później wyekstrahować materiał genetyczny.
Chociaż znakowanie fluorogeniczne jest potężnym narzędziem do śledzenia i sortowania, nie zawsze jest kompatybilne z systemami mikroprzepływowymi opartymi na kroplach i projektami eksperymentalnymi. Ostatnio pojawiły się doniesienia o nowych technikach wykrywania bez znaczników i bez fluorescencji. W 2016 roku Gielen i in. opublikowali urządzenie mikroprzepływowe do sortowania kropel aktywowanego absorbancją (AADS) i zademonstrowali jego funkcjonalność poprzez kierowanie ewolucją dehydrogenazy fenyloalaniny. W 2016 roku Sun i in. zademonstrowali zastosowanie kropelek SE i wysokoprzepustowego MS do przeszukiwania aktywatorów i inhibitorów enzymów poprzez przeszukiwanie biblioteki transaminaz. W 2019 roku Pan i in. pokazał sortowanie kropel według napięć międzyfazowych, na które wpływa zawartość kropelek. W 2020 roku Haidas i in. przedstawili podejście mikroprzepływowe, które wykorzystuje zarówno spektrometrię mas z jonizacją z desorpcją laserową wspomaganą matrycą ( MALDI -MS), jak i mikroskopię fluorescencyjną, które autorzy wykorzystali do pomiaru odpowiednio stężenia i aktywności fitazy w komórkach drożdży. W 2020 roku Holland-Moritz i in. opublikowali swoją metodę sortowania kropelek aktywowanych masą (MADS), która integruje analizę MS z sortowaniem kropelek aktywowanych fluorescencją (FADS). Przy użyciu tej metody kropelki są dzielone i analizowane oddzielnie zarówno za pomocą MS, jak i FADS. Skuteczność tej metody została wykazana przez badanie przesiewowe aktywności biblioteki transaminaz eksprymowanych in vitro .
Eksperci przewidują, że przyszłe innowacje oparte na mikroprzepływach do ukierunkowanych kampanii ewolucyjnych zostaną wprowadzone do przestrzeni komercyjnej, co zaowocuje prostszymi i tańszymi metodami i narzędziami, które można będzie zastosować do enzymów istotnych z punktu widzenia biotechnologii.
Synteza chemiczna
Mikroprzepływy oparte na kroplach stały się ważnym narzędziem w syntezie chemicznej ze względu na kilka atrakcyjnych cech. Reakcje w mikroskali pozwalają na redukcję kosztów dzięki zastosowaniu małych objętości odczynników, szybkich reakcji rzędu milisekund i efektywnej wymiany ciepła, która prowadzi do korzyści dla środowiska, gdy ilość energii zużywanej na jednostkę wzrostu temperatury może być bardzo mała. Stopień kontroli nad lokalnymi warunkami panującymi w urządzeniach często umożliwia wybór jednego produktu nad drugim z dużą precyzją. Dzięki wysokiej selektywności produktu i niewielkim rozmiarom odczynników i środowisk reakcji, wymagane jest mniej rygorystyczne czyszczenie reakcji i mniejsze rozmiary. Mikrodyspersyjne kropelki stworzone przez chemię kropelkową mogą działać jako środowiska, w których zachodzą reakcje chemiczne, jako nośniki odczynników w procesie generowania złożonych nanostruktur . Kropelki można również przekształcić w struktury przypominające komórki, które można wykorzystać do naśladowania biologicznych składników i procesów człowieka.
Jako metoda syntezy chemicznej , Kropelki w urządzeniach mikroprzepływowych działają jak indywidualne komory reakcyjne chronione przed zanieczyszczeniem przez zanieczyszczenie urządzenia przez fazę ciągłą. Korzyści z syntezy przy użyciu tego reżimu (w porównaniu z procesami okresowymi) obejmują wysoką przepustowość , ciągłe eksperymenty, niskie odpady, przenośność i wysoki stopień kontroli syntezy. Niektóre przykłady możliwych syntez to tworzenie mikrosfer półprzewodnikowych i nanocząstek . Detekcja chemiczna jest zintegrowana z urządzeniem, aby zapewnić dokładne monitorowanie reakcji, stosuje się spektroskopię NMR , mikroskopię , detekcję elektrochemiczną i detekcję chemiluminescencyjną . Często pomiary są wykonywane w różnych punktach wzdłuż urządzenia mikroprzepływowego, aby monitorować postęp reakcji.
Zwiększoną szybkość reakcji z udziałem mikrokropelek obserwuje się w reakcji aldolowej eterów i aldehydów sililoenolowych . Przy użyciu opartego na kroplach czas reakcji został skrócony do dwudziestu minut w porównaniu z dwudziestoma czterema godzinami wymaganymi w procesie okresowym. Inni eksperymentatorzy byli w stanie wykazać wysoką selektywność cis- stilbenu względem uprzywilejowanego termodynamicznie trans -stilbenu w porównaniu z reakcją okresową, wykazując wysoki stopień kontroli zapewniany przez kropelki mikroreaktora. Taka stereokontrola jest korzystna dla przemysłu farmaceutycznego. Na przykład L- metotreksat , lek stosowany w chemioterapii, jest łatwiej wchłaniany niż izomer D.
Mikrokapsułki ciekłokrystaliczne
Wytwarzanie ciekłych kryształów było przedmiotem intrygi od ponad 5 dekad ze względu na ich właściwości anizotropowe . Urządzenia mikroprzepływowe mogą być wykorzystywane do syntezy ciekłych kryształów cholesterycznych poprzez nakładanie wielu warstw przypominających skorupy, składających się z różnych emulsji typu olej w wodzie i woda w oleju. Konstrukcja zamkniętych ciekłych kryształów poprzez mikroprzepływowy przepływ kropelek ciekłych kryształów w niemieszającym się oleju pozwala na uzyskanie grubości i składu warstwy monodyspersyjnej emulsji, których wcześniej nie widziano przed pojawieniem się technik mikroprzepływowych. Pojawienie się technologii ciekłokrystalicznej doprowadziło do postępu w wyświetlaczach optycznych stosowanych zarówno w badaniach, jak i markowych produktach konsumenckich, ale nowsze odkrycia otworzyły drzwi do połączenia kombinacji fotonów i konwersji w górę, a także czujników optycznych dla analitów biologicznych.
Synteza mikrocząstek i nanocząstek
Zaawansowane cząstki i materiały oparte na cząstkach, takie jak cząstki polimerów, mikrokapsułki , nanokryształy i klastry lub kulki kryształów fotonicznych, można syntetyzować za pomocą mikroprzepływów opartych na kropelkach. Nanocząstki , takie jak koloidalne nanocząstki CdS i CdS/CdSe rdzeń-powłoka, można również syntetyzować w wielu etapach w milisekundowej skali czasowej w systemie mikroprzepływowym opartym na kroplach.
Nanocząstki, mikrocząstki i klastry koloidalne w urządzeniach mikroprzepływowych są przydatne do takich funkcji, jak dostarczanie leków. Pierwszymi cząstkami wprowadzonymi do systemów opartych na kroplach były żele krzemionkowe o rozmiarach rzędu mikrometrów w celu przetestowania ich zastosowań w produkcji wyświetlaczy i powłok optycznych. Mieszanie cząstek stałych z wodnymi mikrokropelkami wymaga zmian w kanałach mikroprzepływowych, takich jak dodatkowe mieszanki odczynników i wybór określonych materiałów, takich jak krzemionka lub polimery, które nie kolidują z kanałami i substancjami bioaktywnymi zawartymi w kropelkach.
Synteza kopolimerów wymaga mielenia makroskopowych cząsteczek do mikrocząstek o porowatej, nieregularnej powierzchni przy użyciu rozpuszczalników organicznych i technik emulgowania. Te kropelki wstępnie załadowane mikrocząstkami można również szybko przetwarzać za pomocą promieniowania UV. Charakterystyka tych mikrocząstek i nanocząstek obejmuje mikroobrazowanie w celu analizy struktury i identyfikacji mielonego materiału makroskopowego. Techniki takie jak kontrolowane zamykanie pojedynczych pęcherzyków gazu w celu wytworzenia pustych w środku nanocząstek do syntezy mikropęcherzyków o określonej zawartości mają kluczowe znaczenie dla systemów dostarczania leków. Zarówno mikrocząstki na bazie krzemionki, jak i tytanu są stosowane jako trwałe powłoki po użyciu gazu w celu zwiększenia prędkości przepływu fazy wodnej. Wyższa prędkość przepływu pozwala na większą kontrolę nad grubością powłok wodnych. Pojawiająca się wszechstronność nanocząstek można zaobserwować w dostarczaniu mikrokropelek wypełnionych cząsteczkami, które są wykorzystywane we wstrzyknięciach depot do dostarczania leków, a nie w typowym podejściu do wstrzykiwania leków dożylnie . Jest to możliwe dzięki małej grubości otoczek, która typowo mieści się w zakresie od 1 do 50 µm.
Nowsze postępy w cząstkach mikroprzepływowych umożliwiły syntezę cząstek o wielkości nanometra z polimerów pochodzenia biologicznego. Wykorzystując specyficzne konstrukcje wielofazowe skupiające przepływ, które kontrolują prędkość przepływu i temperaturę, można kontrolować wielkość formowanych nanocząstek wraz ze stężeniem i konfiguracją kropelek. Inną techniką tworzenia mikrokropelek obciążonych cząstkami jest użycie nanocząstek lipidowo-hydrożelowych, którymi można manipulować w kropelki o węższym kształcie, co jest przydatne, gdy trzeba użyć miękkich lub kruchych materiałów. Te miękkie materiały są szczególnie ważne przy produkcji proszków . Najnowsze postępy w nanoskali, takie jak urządzenia, które wytwarzają zarówno sferyczne, jak i niesferyczne kropelki, które są ultraszybkie i jednorodnie mieszane, są produkowane do produkcji sproszkowanych cząstek na dużą skalę w zastosowaniach przemysłowych.
Monodyspersyjne nanocząstki są również bardzo interesujące w produkcji katalizatorów . Wydajność wielu heterogenicznych systemów katalitycznych zależy od dużych powierzchni cząstek metali przejściowych. Techniki mikroprzepływowe zostały wykorzystane do wytworzenia nanocząstek złota poprzez interakcję międzyfazową kropelek zawierających chlorek złota, heksan i środek redukujący z otaczającą fazą wodną. Proces ten może również kontrolować zarówno rozmiar, jak i kształt nanocząstek/nanocząstek z precyzją i dużą przepustowością w porównaniu z innymi metodami, takimi jak fizyczne osadzanie z fazy gazowej .
Wykazano, że zastosowanie kropelek zawierających różne materiały, takie jak krzemionka lub metale przejściowe, takie jak złoto, przepływających przez niemieszającą się fazę olejową, jest skuteczne w kontrolowaniu zarówno wielkości nanocząstek, jak i wielkości porów, co pozwala na projektowanie wydajnych absorpcyjnych urządzeń do wychwytywania gazów i heterogeniczne katalizatory. Monodyspersyjne nanocząstki złota i srebra zostały zsyntetyzowane przy użyciu kropelek chlorku złota i srebra, do których dodano środek redukujący w celu rozszczepienia wiązań metal-ligand, co prowadzi do aglomeracji monodyspersyjnych nanocząstek metali, które można łatwo odfiltrować z roztworu.
Synteza cząstek żelowych
Synteza cząstek żelowych, zwanych także hydrożelami, mikrożelami i nanożelami, od kilkudziesięciu lat jest przedmiotem zainteresowania zarówno naukowców, jak i przemysłu. Podejście oparte na mikroprzepływach do syntezy tych cząstek hydrożelu jest użytecznym narzędziem ze względu na wysoką przepustowość, monodyspersyjność cząstek i redukcję kosztów dzięki zastosowaniu małych objętości odczynników. Jednym z kluczowych wyzwań na początku w dziedzinie żeli było tworzenie cząstek monodyspersyjnych. Początkowo techniki oparte na polimeryzacji były stosowane do tworzenia masowych mikrocząstek o wielkości polidyspersyjnej. Techniki te generalnie koncentrowały się na użyciu roztworu wodnego, który energicznie mieszano w celu utworzenia emulsji. Ostatecznie opracowano technikę tworzenia monodyspersyjnych, biodegradowalnych mikrożeli poprzez wytwarzanie emulsji O/W w liniowej geometrii kanału generującego krople. Ta geometria złącza w połączeniu z fazą ciągłą nasyconą środkiem powierzchniowo czynnym była odpowiedzialna za tworzenie mikrożeli wykonanych z poli-dex-HEMA. Inne geometrie urządzeń, w tym tworzenie typu T-skrzyżowania, są również wykonalne i zostały wykorzystane do wytworzenia żeli na bazie krzemionki.
Po ustaleniu tych metod wysiłki skoncentrowano na zastosowaniu funkcjonalności do tych cząstek. Przykłady obejmują cząstki kapsułkowane z bakteriami, cząstki kapsułkowane z lekiem lub białkiem oraz cząstki żelu magnetycznego. Wstawienie tych składników funkcjonalnych do struktury żelu może być tak proste, jak włączenie składnika do fazy rozproszonej. W niektórych przypadkach preferowane są pewne geometrie urządzeń, na przykład zastosowano złącze skupiające przepływ do kapsułkowania bakterii w mikrocząstkach agarozy. Emulsje wielokrotne są interesujące w zastosowaniach farmaceutycznych i kosmetycznych i są tworzone przy użyciu dwóch kolejnych połączeń skupiających przepływ. Można również zsyntetyzować bardziej skomplikowane cząstki, takie jak cząstki Janus, które mają powierzchnie o dwóch lub więcej różnych właściwościach fizycznych.
Niektóre przykłady rosnącego zastosowania cząstek żelowych obejmują dostarczanie leków, zastosowania biomedyczne i inżynierię tkankową, a wiele z tych zastosowań wymaga cząstek monodyspersyjnych, w przypadku których preferowane jest podejście oparte na mikroprzepływach. Metody emulgowania w masie są jednak nadal aktualne, ponieważ nie wszystkie zastosowania wymagają jednolitych mikrocząstek. Przyszłość mikroprzepływowej syntezy żeli może polegać na opracowaniu technik tworzenia masowych ilości tych jednorodnych cząstek, aby uczynić je bardziej dostępnymi komercyjnie/przemysłowo.
Niedawne postępy w mikroprzepływach kropelkowych umożliwiły również syntezę in situ włókien hydrożelowych zawierających wodne kropelki o kontrolowanej morfologii. Włókna hydrożelowe stanowią intrygującą opcję biokompatybilnego materiału do dostarczania leków i biodrukowania materiałów, które mogą naśladować zachowanie macierzy pozakomórkowej. Ta metoda mikroprzepływowa różni się od tradycyjnej metody syntezy z przędzeniem na mokro dzięki zastosowaniu kropelek wody w niemieszającym się strumieniu oleju zamiast wytłaczania roztworu masowego o tym samym składzie, zmieszanego poza miejscem. Możliwość kontrolowania wielkości, szybkości przepływu i składu kropelek zapewnia możliwość precyzyjnego dostrojenia morfologii włókien w celu dopasowania do określonego zastosowania w bioanalizie i emulacji funkcji anatomicznych.
Ekstrakcja i transfer fazowy z wykorzystaniem mikroprzepływów kropelkowych
Ekstrakcja ciecz-ciecz to metoda stosowana do oddzielania analitu od złożonej mieszaniny; w tej metodzie związki rozdzielają się na podstawie ich względnej rozpuszczalności w różnych niemieszających się fazach ciekłych. Aby przezwyciężyć niektóre wady związane z powszechnymi metodami laboratoryjnymi, takimi jak metoda wytrząsania w kolbie, zastosowano metody ekstrakcji mikroprzepływowej ciecz-ciecz. Systemy mikroprzepływowe oparte na kroplach wykazały zdolność do manipulowania dyskretnymi objętościami płynów w niemieszających się fazach o niskich liczbach Reynoldsa. i reżimy przepływu laminarnego. Metody w mikroskali skracają wymagany czas, zmniejszają objętość próbki i odczynnika oraz umożliwiają automatyzację i integrację. W niektórych badaniach wydajność ekstrakcji mikroprzepływowej opartej na kropelkach jest zbliżona do metody wytrząsania kolby. Badanie, w którym porównano metodę wytrząsania w kolbie i mikroprzepływową metodę ekstrakcji ciecz-ciecz dla 26 związków i stwierdzono ścisłą korelację między otrzymanymi wartościami (R2 = 0,994).
Wykazano również, że mikroprzepływowe urządzenia do ekstrakcji ciecz-ciecz można zintegrować z innymi przyrządami do wykrywania wyekstrahowanych analitów. Na przykład ekstrakcję mikroprzepływową można zastosować do ekstrakcji analitu początkowo w fazie wodnej, takiej jak kokaina w ślinie, a następnie połączyć ją z spektroskopią IR na chipie w celu wykrycia. Wykazano, że ekstrakcja mikroprzepływowa ciecz-ciecz jest korzystna w wielu zastosowaniach, takich jak badania farmakokinetyczne leków, w których potrzebna jest tylko niewielka liczba komórek, oraz w dodatkowych badaniach, w których wymagane są mniejsze objętości odczynników.
Wykrywanie kropli
Metody separacji
Systemy mikroprzepływowe oparte na kroplach można łączyć z metodami separacji do określonych zadań. Powszechne techniki separacji połączone z układami mikroprzepływowymi opartymi na kropelkach obejmują wysokosprawną chromatografię cieczową ( HPLC ) i elektroforezę .
Wysokosprawna chromatografia cieczowa
Wiele form chromatografii, w tym wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC), ultrasprawna chromatografia cieczowa nanoflow (nano-UPLC lub nano-LC) oraz dwuwymiarowa chromatografia z przepływem kapilarnym (LC kapilarna), zostało włączonych do dziedziny mikroprzepływy oparte na kroplach. W mikroskali techniki separacji chemicznej, takie jak HPLC, mogą być stosowane zarówno w analizie biologicznej, jak i chemicznej. W dziedzinie mikroprzepływów techniki te zastosowano w układach mikroprzepływowych na trzech różnych etapach procesu mikroprzepływowego. Kolumny HPLC typu off-chip służą do oddzielania analitów przed wprowadzeniem ich do urządzenia mikroprzepływowego w celu frakcjonowania i analizy. Kolumny HPLC można również wbudowywać bezpośrednio w mikroprzepływowe układy laboratoryjne, tworząc monolityczne urządzenia hybrydowe zdolne do separacji chemicznej, a także tworzenia kropel i manipulowania nimi. Ponadto HPLC jest stosowana na końcu chemii mikroprzepływowej opartej na kroplach jako sposób oczyszczania, analizy i / lub ilościowego określania produktów eksperymentu.
Kropelkowe urządzenia mikroprzepływowe sprzężone z HPLC mają wysoką czułość wykrywania, zużywają małe ilości odczynników, mają krótkie czasy analizy i minimalne zanieczyszczenie krzyżowe analitów, co czyni je skutecznymi w wielu aspektach. Jednak nadal istnieją problemy związane z chromatografią w mikroskali, takie jak dyspersja rozdzielonych pasm, dyfuzja i „objętość martwa” w kanałach po rozdzieleniu. Jednym ze sposobów obejścia tych problemów jest użycie kropelek do podziału pasm separacyjnych, co zwalcza dyfuzję i utratę rozdzielonych analitów. We wczesnych próbach zintegrowania chromatografii z mikrofluidyką kropelkową, niższe prędkości przepływu i ciśnienia wymagane dla LC kapilarnej 2-D stanowiły mniejszą przeszkodę do pokonania przy łączeniu tych technologii i umożliwiły połączenie wielu technik separacji 2-D w jednym urządzeniu ( tj. HPLC x LC , LC x LC i HPLC x HPLC). Autosamplery HPLC zasilające urządzenia mikroprzepływowe wykorzystały dyspersję występującą między separacją a tworzeniem kropel, aby podawać impulsy gradientu analitów do urządzeń mikroprzepływowych, w których produkcja tysięcy pikolitrowych kropel wychwytuje unikalne stężenia analitu. W podobnych podejściach wykorzystano możliwości pobierania pompy strzykawkowej w celu wyrównania stosunkowo wysokich prędkości przepływu niezbędnych do HPLC z niższymi prędkościami przepływu ciągłego medium, powszechnymi w urządzeniach mikroprzepływowych. Rozwój nano-LC lub nano-UPLC dostarczył kolejnej możliwości sprzężenia z urządzeniami mikroprzepływowymi, tak że można tworzyć duże biblioteki kropel z wieloma wymiarami informacji przechowywanymi w każdej kropli. Zamiast identyfikować piki i przechowywać je jako pojedynczą próbkę, jak widać w standardowej LC, te biblioteki kropel pozwalają na zachowanie określonego stężenia analitu wraz z jego tożsamością. Co więcej, możliwość przeprowadzenia frakcjonowania z wysoką częstotliwością bezpośrednio z eluentu kolumny nano-LC znacznie zwiększa rozdzielczość pików i poprawia ogólną jakość separacji w porównaniu z urządzeniami nano-LC z przepływem ciągłym.
Kolumna HPLC została najpierw wbudowana bezpośrednio w urządzenie mikroprzepływowe przy użyciu TPE zamiast PDMS do wytworzenia urządzenia. Dodatkowa wytrzymałość TPE sprawiła, że był w stanie wytrzymać wyższe ciśnienia potrzebne do HPLC, tak że pojedynczy mikroprzepływowy układ laboratoryjny mógł przeprowadzać chemiczną separację, frakcjonowanie i dalszą manipulację kropelkami. Aby poprawić jakość wyników chromatograficznych, solidniejsze urządzenia wykonane ze szkła wykazały zdolność do wytrzymywania znacznie większego ciśnienia niż TPE. Osiągnięcie tych wyższych ciśnień w celu zwiększenia stopnia separacji i wyeliminowania wszystkich martwych objętości poprzez natychmiastowe tworzenie kropel pokazało potencjał mikroprzepływów kropelkowych do rozszerzenia i poprawy możliwości separacji HPLC.
Elektroforeza
Elektroforeza kapilarna (CE) i mikrokapilarna elektroforeza żelowa (μCGE) to dobrze znane metody elektroforezy mikroczipowej (MCE), które mogą zapewnić liczne korzyści analityczne, w tym wysoką rozdzielczość, wysoką czułość i skuteczne sprzężenie ze spektrometrią mas (MS). Elektroforeza mikroczipowa może być ogólnie stosowana jako metoda wysokowydajnych procesów przesiewowych, które pomagają odkrywać i oceniać leki. Przy użyciu MCE, a konkretnie CE, urządzenia do elektroforezy mikrokapilarnej w żelu (μCGE) są tworzone w celu przetwarzania próbek DNA o dużej liczbie, co czyni je dobrym kandydatem do analizy DNA. Urządzenia μCGE są również praktyczne do celów separacji, ponieważ wykorzystują separację online, charakteryzację, enkapsulację i selekcję różnych analitów pochodzących z próbki złożonej. Wszystkie te zalety metod MCE przekładają się na urządzenia mikroprzepływowe. Powodem, dla którego metody MCE są łączone z urządzeniami mikroprzepływowymi opartymi na kroplach, jest możliwość analizowania próbek w skali nanolitra. Stosowanie metod MCE na małą skalę zmniejsza koszty i zużycie odczynników. Podobnie jak w przypadku HPLC, w elektroforezie kapilarnej stosuje się techniki wykrywania oparte na fluorescencji, dzięki czemu metody te są praktyczne i mogą być stosowane w takich dziedzinach, jak biotechnologia, chemia analityczna i opracowywanie leków. Te metody oparte na MCE i inne metody oparte na elektroforezie zaczęły się rozwijać, gdy elektroforeza kapilarna zyskała popularność w latach 80.
Spektrometria mas ( MS ) jest niemal uniwersalną techniką detekcji, uznawaną na całym świecie za złoty standard identyfikacji wielu związków. MS to technika analityczna, w której substancje chemiczne są jonizowane i sortowane przed wykryciem, a otrzymane widmo masowe jest wykorzystywane do identyfikacji cząsteczek macierzystych jonów. To sprawia, że MS, w przeciwieństwie do innych technik wykrywania (takich jak fluorescencja), jest wolne od znaczników; tj. nie ma potrzeby wiązania dodatkowych ligandów lub grup z cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania, aby otrzymać sygnał i zidentyfikować związek.
Spekrtometria masy
Spektrometria mas (MS) jest niemal uniwersalną techniką detekcji, która jest uznawana na całym świecie za złoty standard identyfikacji wielu związków. MS to technika analityczna, w której substancje chemiczne są jonizowane i sortowane przed wykryciem, a otrzymane widmo masowe jest wykorzystywane do identyfikacji cząsteczek macierzystych jonów. To sprawia, że MS, w przeciwieństwie do innych technik wykrywania (takich jak fluorescencja ), jest wolne od znaczników; tj. nie ma potrzeby wiązania dodatkowych ligandów lub grup z cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania, aby otrzymać sygnał i zidentyfikować związek.
Istnieje wiele przypadków, w których inne metody spektroskopowe, takie jak jądrowy rezonans magnetyczny ( NMR ), fluorescencja , podczerwień lub Ramana , nie są opłacalne jako samodzielne metody ze względu na szczególny skład chemiczny kropelek. Często te kropelki są wrażliwe na znaczniki fluorescencyjne lub zawierają cząsteczki, które są poza tym nieokreślonie podobne, gdzie MS można zastosować wraz z innymi metodami do scharakteryzowania konkretnego analitu będącego przedmiotem zainteresowania. [56] [57] Jednak MS dopiero niedawno (w ostatniej dekadzie) zyskał popularność jako metoda wykrywania mikroprzepływów opartych na kroplach (i mikroprzepływów jako całości) ze względu na wyzwania związane ze sprzężeniem spektrometrów mas z tymi zminiaturyzowanymi urządzeniami. Trudność separacji/oczyszczania sprawia, że całkowicie mikroprzepływowe systemy sprzężone ze spektrometrią mas są idealne w dziedzinie proteomiki [58] [59] kinetyki enzymów, [60] odkrywania leków [37] i badań przesiewowych chorób noworodków. [61] Dwie podstawowe metody jonizacji do analizy masy stosowane obecnie w mikroprzepływach opartych na kroplach to desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą ( MALDI ) [62] [63] i jonizacja przez elektrorozpylanie ( ESI ). Opracowywane są również dodatkowe metody sprzęgania, takie jak (między innymi) nebulizacja powierzchniowych fal akustycznych ( SAWN ) i jonizacja w sprayu papierowym na zminiaturyzowane MS. [64]
Jonizacja przez elektrorozpylanie
Jedną z komplikacji związanych z połączeniem MS z mikroprzepływami opartymi na kropelkach jest to, że zdyspergowane próbki są wytwarzane przy stosunkowo niskich prędkościach przepływu w porównaniu z tradycyjnymi technikami wtrysku MS. ESI jest w stanie z łatwością zaakceptować te niskie prędkości przepływu i jest obecnie powszechnie wykorzystywany do analizy mikroprzepływowej on-line. ESI i MALDI oferują wysoką przepustowość rozwiązania problemu wykrywania kropelek bez etykiet, ale ESI wymaga mniej intensywnego przygotowania próbki i elementów produkcyjnych, które można skalować do skali urządzenia mikroprzepływowego. [68] ESI polega na przyłożeniu wysokiego napięcia do strumienia nośnego kropelek zawierających analit, co powoduje aerozolizację strumienia, a następnie wykrywanie w obszarze analizatora różnicującego potencjały. Płyn nośny w kropelkowym urządzeniu mikroprzepływowym, zazwyczaj olej, często stanowi przeszkodę w ESI. Olej, gdy część strumienia kropel trafia do przyrządu ESI-MS, może powodować stałe napięcie tła zakłócające wykrywanie kropelek próbki. Te zakłócenia tła można usunąć, zmieniając olej używany jako płyn nośny i regulując napięcie używane do elektrorozpylania.
Wielkość kropelek, kształt stożka Taylora i szybkość przepływu można kontrolować, zmieniając różnicę potencjałów i temperaturę osuszającego (w celu odparowania rozpuszczalnika otaczającego analit) strumienia gazu (zwykle azotu). [69] Ponieważ ESI pozwala na wykrywanie kropelek w trybie online, można rozwiązać inne problemy stwarzane przez systemy oparte na segmentacji lub wykrywaniu poza chipem, takie jak minimalizacja rozcieńczenia próbki (kropli), co jest szczególnie ważne w mikroprzepływowej detekcji kropel, w której próbki analitu są już rozcieńczony do najniższego eksperymentalnie istotnego stężenia. [70]
Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą
MALDI charakteryzuje się zastosowaniem lasera ultrafioletowego ( UV ) do wyzwalania ablacji analitów, które są zmieszane z matrycą skrystalizowanych cząsteczek o wysokiej absorpcji optycznej. Jony w powstałych ablowanych gazach są następnie protonowane lub deprotonowane przed przyspieszeniem do spektrometru masowego. Podstawową zaletą wykrywania MALDI w porównaniu z ESI w urządzeniach mikroprzepływowych jest to, że MALDI pozwala na znacznie łatwiejsze multipleksowanie [65] , co jeszcze bardziej zwiększa ogólną przepustowość urządzenia [63] , a także mniejszą zależność od ruchomych części i brak stożka Taylora problemy ze stabilnością powodowane przez prędkości przepływu w skali mikroprzepływów. [66] Szybkość wykrywania MALDI, wraz ze skalą kropelek mikroprzepływowych, pozwala na udoskonalenie technik w skali makro, zarówno w zakresie przepustowości, jak i rozdzielczości czasu przelotu ( TOF ). [60] [63] Tam, gdzie typowe konfiguracje wykrywania MS często wykorzystują techniki separacji, takie jak chromatografia, konfiguracje MALDI wymagają przed wykryciem wymieszania wystarczająco oczyszczonej próbki z wcześniej określonymi matrycami organicznymi, odpowiednimi dla określonej próbki. [58] Skład matrycy MALDI musi być dostrojony w celu uzyskania odpowiedniej fragmentacji i ablacji analitów.
Jedną z metod uzyskiwania oczyszczonej próbki z mikroprzepływów opartych na kropelkach jest zakończenie kanału mikroprzepływowego na płytce MALDI, przy czym kropelki wody tworzą się na obszarach hydrofilowych na płytce. Następnie pozostawia się rozpuszczalnik i płyn nośny do odparowania, pozostawiając jedynie wysuszone kropelki badanej próbki, po czym na wysuszone kropelki nakłada się matrycę MALDI. To przygotowanie próbki ma znaczące ograniczenia i komplikacje, których obecnie nie można przezwyciężyć dla wszystkich rodzajów próbek. Ponadto matryce MALDI są preferencyjnie w znacznie wyższych stężeniach niż próbka analitu, co pozwala na włączenie mikroprzepływowego transportu kropel do produkcji matrycy MALDI online. Ze względu na małą liczbę znanych matryc oraz charakter prób i błędów w znalezieniu odpowiednich nowych kompozycji matryc [67] może to być decydującym czynnikiem przy stosowaniu innych form spektroskopii w porównaniu z MALDI.
Spektroskopia Ramana
Spektroskopia ramanowska to technika spektroskopowa, która zapewnia nieniszczącą analizę zdolną do identyfikacji składników w mieszaninach ze specyficznością chemiczną bez skomplikowanego przygotowania próbki. Spektroskopia ramanowska opiera się na rozpraszaniu fotonów po promieniowaniu światła widzialnego, gdzie zmiana energii fotonów odpowiada informacjom o modach wibracyjnych układu i ich częstotliwościach. Po uzyskaniu modów wibracyjnych można zarówno dokonać, jak i wzmocnić jakościowe klasyfikacje systemu.
Spektroskopia Ramana dobrze sprawdza się równolegle z urządzeniami mikroprzepływowymi w wielu jakościowych zastosowaniach biologicznych. W niektórych zastosowaniach spektroskopia Ramana jest preferowana w stosunku do innych metod wykrywania, takich jak spektroskopia w podczerwieni (IR), ponieważ woda ma silny sygnał interferencyjny z IR, ale nie z ramanowskim. Podobnie metody takie jak wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC), jądrowy rezonans magnetyczny (NMR), spektrometria mas (MS) lub chromatografia gazowa (GC) również nie są idealne, ponieważ metody te wymagają większych rozmiarów próbek. Ponieważ mikroprzepływy umożliwiają eksperymenty z małymi objętościami (w tym analizę pojedynczych komórek lub kilku komórek), Raman jest wiodącą metodą wykrywania mikroprzepływów. W szczególności integracja Ramana z urządzeniami mikroprzepływowymi ma silne zastosowanie w systemach, w których konieczna jest identyfikacja lipidów, co jest powszechne w badaniach nad biopaliwami . Na przykład test fluorescencji lipidów nie jest wystarczająco selektywny, a zatem nie może zidentyfikować różnic molekularnych w sposób, w jaki Raman może to zrobić za pomocą wibracji molekularnych. Raman, w połączeniu z urządzeniami mikroprzepływowymi, może również monitorować mieszanie płynów i wychwytywanie cieczy, a także może wykrywać fazy stałe i gazowe w platformach mikroprzepływowych, co ma zastosowanie do badania rozpuszczalności gaz-ciecz.
Spektroskopia ramanowska w urządzeniach mikroprzepływowych jest stosowana i wykrywana za pomocą zintegrowanego światłowodu w chipie mikroprzepływowym lub poprzez umieszczenie urządzenia na mikroskopie ramanowskim . Ponadto niektóre układy mikroprzepływowe wykorzystują metaliczny koloid lub nanocząsteczki w roztworze, aby wykorzystać wzmocnioną powierzchniowo spektroskopię Ramana (SERS). SERS może poprawić rozpraszanie ramanowskie nawet o współczynnik 10 11 , tworząc kompleksy przenoszenia ładunku na powierzchniach. Wynika z tego, że urządzenia te są zwykle wytwarzane z nanoporowatych poliwęglanowych , co pozwala na łatwe powlekanie nanocząstek . Jednakże, jeśli jest wykonany z polidimetylosiloksanu (PDMS), może wystąpić interferencja sygnału z widmem Ramana. PDMS generuje silny sygnał ramanowski, który może łatwo obezwładnić i zakłócić żądany sygnał. Powszechnym rozwiązaniem tego problemu jest wytwarzanie urządzenia mikroprzepływowego w taki sposób, aby konfokalny otworek mógł być użyty do lasera Ramana. Typowa konfokalna mikroskopia ramanowska pozwala na uzyskanie informacji spektroskopowych z małych ogniskowych objętości mniejszych niż 1 mikron sześcienny, a zatem mniejszych niż wymiary kanałów mikroprzepływowych. Sygnał Ramana jest z natury słaby; dlatego w przypadku krótkich czasów detekcji przy małych objętościach próbek w urządzeniach mikroprzepływowych wykorzystuje się wzmocnienie sygnału. Wielofotonowa spektroskopia ramanowska, taka jak stymulowana spektroskopia ramanowska (SRS) lub koherentna spektroskopia ramanowska antystokesowska (CARS), pomaga wzmacniać sygnały z substancji w urządzeniach mikroprzepływowych.
W mikroprzepływach opartych na kroplach detekcja ramanowska zapewnia analizę online wielu analitów w kropelkach lub fazie ciągłej. Sygnał Ramana jest wrażliwy na zmiany stężenia, dlatego rozpuszczalność i kinetykę mieszania układu mikroprzepływowego opartego na kroplach można wykryć za pomocą Ramana. Rozważania obejmują współczynnika załamania światła na granicy faz kropli i fazy ciągłej, a także między połączeniami płynu i kanału.
Detekcja fluorescencyjna
Spektroskopia fluorescencyjna jest jedną z najpowszechniejszych technik wykrywania kropel. Zapewnia szybką reakcję, a dla odpowiednich analitów ma silny sygnał. Zastosowanie spektroskopii fluorescencyjnej w mikrofluidyce ma podobny format, jak większość innych fluorescencyjnych technik analitycznych. Źródło światła jest używane do wzbudzania cząsteczek analitu w próbce, po czym analit fluoryzuje, a odpowiedź fluorescencji jest mierzonym wyjściem. Kamery mogą być używane do przechwytywania sygnału fluorescencyjnego kropelek, a filtry są często używane do odfiltrowywania rozproszonego światła wzbudzającego. W mikroprzepływowej detekcji kropel konfiguracja eksperymentalna instrumentu fluorescencyjnego może się znacznie różnić. Typowym ustawieniem w wykrywaniu kropelek fluorescencyjnych jest użycie mikroskopu epifluorescencyjnego . To czasami wykorzystuje geometrię konfokalną, która może się różnić w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Na przykład Jeffries i in. zgłosili sukces w eksploracji ortogonalnej geometrii konfokalnej, w przeciwieństwie do standardowej geometrii epi. Jednak zbadano inne konfiguracje wykrywania fluorescencji, ponieważ mikroskopy epifluorescencyjne mogą być drogie i trudne w utrzymaniu. Cole i in. zaproponowali i przetestowali układ eksperymentalny ze światłowodami do przeprowadzania analizy fluorescencyjnej kropelek mikroprzepływowych.
Detekcja fluorescencyjna kropelek ma wiele zalet. Po pierwsze, może obsłużyć dużą i szybką przepustowość. Analizę tysięcy próbek można przeprowadzić w krótkim czasie, co jest korzystne przy analizie dużej liczby próbek. Kolejną zaletą jest dokładność metody. W analizie przeprowadzonej przez Li i wsp. stwierdzono, że zastosowanie technik detekcji fluorescencyjnej dało 100% dokładność detekcji w 13 z 15 zebranych obrazów. Pozostałe dwa miały błędy względne około 6%. Kolejną zaletą detekcji fluorescencyjnej jest możliwość ilościowej analizy rozmieszczenia kropel w próbce. Odbywa się to za pomocą pomiarów czasowych i prędkości przepływu analitu. Odstęp czasowy między sygnałami pozwala na obliczenie odstępu między kroplami. Dalsza analiza fluorescencji mikroprzepływowych próbek kropelek może być wykorzystana do pomiaru czasu życia fluorescencji próbek, dostarczając dodatkowych informacji, których nie można uzyskać w przypadku samych pomiarów intensywności fluorescencji.
Zastosowania wykrywania fluorescencji są zróżnicowane, a wiele z nich koncentruje się na zastosowaniach biologicznych. Frenz i in. wykorzystali detekcję fluorescencyjną kropelek do zbadania kinetyki enzymów. W tym eksperymencie b-laktamaza wchodziła w interakcję z fluorocyliną, substratem fluorogennym. Fluorescencję kropelek mierzono w wielu odstępach czasu, aby zbadać zmianę w czasie. Ta metoda wykrywania wykracza jednak poza zastosowania biologiczne i pozwala na fizyczne badanie powstawania i ewolucji kropel. Na przykład Sakai i in. wykorzystali detekcję fluorescencji do monitorowania wielkości kropel. Dokonano tego poprzez zebranie danych fluorescencyjnych w celu obliczenia stężenia barwnika fluorescencyjnego w pojedynczej kropli, co umożliwiło monitorowanie wzrostu wielkości. Zastosowanie technik wykrywania fluorescencji można rozszerzyć na zastosowania wykraczające poza gromadzenie danych; szeroko stosowaną metodą sortowania komórek i kropelek w mikroprzepływach jest sortowanie aktywowane fluorescencją, w którym kropelki są sortowane do różnych kanałów lub otworów zbiorczych na podstawie ich intensywności fluorescencji.
Fluorescencyjne kropki kwantowe zostały wykorzystane do opracowania platform bioczujnikowych i dostarczania leków w urządzeniach mikroprzepływowych. Kropki kwantowe są przydatne ze względu na ich mały rozmiar, precyzyjną długość fali wzbudzenia i wysoką wydajność kwantową . Są to zalety w stosunku do tradycyjnych barwników, które mogą zakłócać działanie badanego związku. Jednak masowe tworzenie i koniugacja kropek kwantowych z cząsteczkami będącymi przedmiotem zainteresowania pozostaje wyzwaniem. Urządzenia mikroprzepływowe, które sprzęgają nukleotydy z kropkami kwantowymi, zostały zaprojektowane w celu rozwiązania tego problemu poprzez znaczne skrócenie czasu koniugacji z dwóch dni do minut. Koniugaty DNA-kropka kwantowa mają znaczenie w wykrywaniu komplementarnego DNA i miRNA w systemach biologicznych.
Detekcja elektrochemiczna
Detekcja elektrochemiczna służy jako niedroga alternatywa nie tylko do pomiaru składu chemicznego w niektórych przypadkach, ale także długości kropel, częstotliwości, przewodnictwa i prędkości przy dużych prędkościach i zwykle przy bardzo niewielkiej kompensacji przestrzeni na chipie. Metoda została po raz pierwszy omówiona w Luo et al. gdzie zespół był w stanie z powodzeniem zmierzyć wielkość i stężenie jonów w pikolitrowych kropelkach zawierających rozpuszczone jony NaCl. Zwykle wykonuje się to za pomocą zestawu lub serii mikroelektrod , które mierzą zakłócenia prądu, mniejsze krople dają mniejsze zakłócenia, a większe krople dają dłuższe krzywe. Liczba perturbacji w prądzie może również wskazywać częstotliwość kropelek przechodzących przez elektrodę jako sposób na określenie szybkości kropelek. Zaproponowano kilka różnych związków do stosowania w elektrodach, ponieważ dokładne, precyzyjne i znaczące odczyty mogą być trudne w mikroskali. Związki te obejmują elektrody z pasty węglowej , które są nakładane bezpośrednio na chip, po czerń platynową osadzoną elektrolitycznie na drucie platynowym w tandemie z chlorkiem srebra na mikroelektrodzie srebrnej w celu zwiększenia aktywności i pola powierzchni.
Jeśli chodzi o skład chemiczny, odczyty uzyskuje się poprzez analizę chronoamperometryczną związków elektroaktywnych w kropelkach, jak podano powyżej. Potencjał zmienia się w zależności od jonów żywotnych elektrycznie, rozpuszczonych jonów sodu i chloru w tym eksperymencie oraz ich stężeń w każdej kropli. Inna grupa wykazała, z serią kontroli, że zmieszany skład kropelek zawierający jodek potasu został dokładnie wykryty w skali czasu sekund z optymalnymi zakresami napięcia, prędkości i pH. Oprócz tego rozwija się bardziej unikalne podejście w zakresie odczytów chronoamperometrycznych, w których stworzono układy magneto-fluidyczne , a odczyty potencjału są mierzone w płynach nieaktywnych elektro-elektrycznie poprzez rozpuszczanie mikrocząstek magnetycznych w odczynniku. Metoda ta została rozszerzona do cyfrowego układu mikroprzepływowego (DMF), w którym złote i srebrne elektrody w połączeniu z rozpuszczonymi mikrocząstkami magnetycznymi w płynach zastąpiły typową detekcję kropel opartą na fluorescencji w teście immunologicznym analitów biomarkerów.
Powyższy eksperyment przeprowadzony przez Shamsiego i wsp. nawiązuje do głównego zastosowania detekcji elektrochemicznej w mikroprzepływach; biosensing do różnych pomiarów, takich jak kinetyka enzymów i testy biologiczne wielu innych typów komórek. Procesy te wymagają zwiększonej kontroli systemu, ponieważ wraz ze wzrostem natężenia przepływu zmniejsza się wykrywalność enzymów. Chociaż w miarę postępu reakcji enzymatycznej odczyt amperometryczny również będzie ewoluował, umożliwiając szybkie monitorowanie kinetyki. Ponadto określone środki powierzchniowo czynne mogą nie być biokompatybilne z układem, wpływając na wykrywanie enzymu i przekrzywienia. Zasięg tego zastosowania miał nawet wpływ na akwakulturę i ekonomię, ponieważ do szybkiego testowania świeżości ryb zastosowano wykrywanie elektrochemiczne. Zastosowanie tej metody wykrywania znajduje się przede wszystkim w elektrozwilżaniu dielektrycznych DMF, gdzie urządzenie elektrody czujnikowej można rekonfigurować i ma dłuższą żywotność, a jednocześnie zapewnia dokładne wyniki.