Obciążenie mutacyjne guza
Obciążenie mutacyjne guza (w skrócie TMB ) to cecha genetyczna tkanki nowotworowej, która może być pouczająca dla badań nad rakiem i leczenia. Definiuje się ją jako liczbę mutacji niedziedzicznych na milion zasad (Mb) badanej sekwencji genomowej, a jej pomiar umożliwiło sekwencjonowanie nowej generacji . TMB wykazał potencjał jako biomarker prognostyczny z kilkoma zastosowaniami, w tym powiązaniami zgłaszanymi między różnymi poziomami TMB a odpowiedzią pacjenta na terapię inhibitorem immunologicznego punktu kontrolnego (ICI) w różnych nowotworach.
Chociaż zarówno TMB, jak i sygnatury mutacji dostarczają nam krytycznych informacji o zachowaniu raka, mają one różne definicje. TMB definiuje się jako liczbę mutacji somatycznych/megazasadę, podczas gdy sygnatury mutacji to odrębne wzorce mutacji podstawień pojedynczych zasad, podstawień podwójnych zasad lub małych insercji i delecji w guzach. Na przykład COSMIC 1 charakteryzuje się enzymatyczną deaminacją cytozyny do tyminy i jest związana z wiekiem osobnika.
Naukowcy postulują, że wysoki TMB jest związany ze zwiększoną ilością neoantygenów, które są swoistymi markerami nowotworowymi prezentowanymi przez komórki. Wzrost tych antygenów może następnie prowadzić do zwiększonego wykrywania komórek nowotworowych przez układ odpornościowy i silniejszej aktywacji cytotoksycznych limfocytów T. Aktywacja komórek T jest dodatkowo regulowana przez immunologiczne punkty kontrolne , które mogą być prezentowane przez komórki nowotworowe, dlatego leczenie ICI może prowadzić do poprawy przeżycia pacjentów .
W dniu 16 czerwca 2020 r. Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków rozszerzyła zatwierdzenie leku immunoterapeutycznego pembrolizumab do leczenia wszelkich zaawansowanych raków guzów litych z TMB większym niż 10 mutacji na Mb i ciągłym wzrostem po wcześniejszym leczeniu. To pierwszy raz, kiedy FDA zatwierdziła lek, którego stosowanie opiera się na pomiarach TMB.
Znaczenie
TMB jako biomarker
Jednym z mechanizmów przetrwania w nowotworach jest zwiększenie ekspresji cząsteczek immunologicznego punktu kontrolnego , które mogą wiązać się z komórkami T specyficznymi dla nowotworu i inaktywować je, tak aby komórki nowotworowe nie mogły zostać wykryte i zabite. Wykazano, że ICI poprawiają odpowiedź pacjentów i wskaźniki przeżycia , ponieważ pomagają układowi odpornościowemu atakować komórki nowotworowe. Istnieją jednak różnice w odpowiedzi na ICI wśród pacjentów i bardzo ważne jest, aby wiedzieć, którzy pacjenci mogą odnieść korzyści z terapii ICI. , że ekspresja PD-L1 (ligand 1 programowanej śmierci; jeden z immunologicznych punktów kontrolnych ) jest dobra biomarker terapii blokującej PD-L1 w niektórych nowotworach. Istnieje jednak potrzeba opracowania lepszych biomarkerów, ponieważ w przypadku PD-L1 występują pewne błędy predykcyjne wyrażenie. Badania nad TMB pokazały, że istnieje związek między wynikiem pacjentów (terapii ICI) a wartością TMB. Zaproponowano, że TMB może być stosowany jako predykcyjny marker odpowiedzi w terapii ICI w wielu typach nowotworów. Ponadto TMB może być pomocny w identyfikacji osób, które mogą odnieść korzyść z terapii ICI z nowotworami, które generalnie mają niskie wartości TMB. Ponadto wykazano, że nowotwory z wyższymi wartościami TMB zwykle powodują większą liczbę neoantygenów, antygenów które są prezentowane na powierzchni komórek nowotworowych, które są zwykle wynikiem mutacji zmiany sensu. Tak więc TMB może być dobrym estymatorem obciążenia neoantygenem i może pomóc znaleźć pacjentów, którzy mogą odnieść korzyść z terapii ICI, zwiększając szansę wykrycia neoantygenów. Należy jednak zauważyć, że do oszacowania TMB wykorzystano różne platformy sekwencjonowania i potoki bioinformatyczne i ważne jest zharmonizowanie protokołów i procedur oznaczania ilościowego TMB, zanim będzie można go użyć jako wiarygodnego biomarkera . Podjęto pewne wysiłki w celu ujednolicenia tych metod.
Odpowiedź na leczenie
Stwierdzono, że TMB koreluje z odpowiedzią pacjenta na terapie, takie jak inhibitory immunologicznego punktu kontrolnego (ICI). Analiza dużej kohorty pacjentów otrzymujących terapię ICI wykazała, że wyższe poziomy TMB (≥ 20 mutacji/Mb) odpowiadały 58% odsetkowi odpowiedzi na ICI, podczas gdy niższe poziomy TMB (<20 mutacji/Mb) zmniejszały odpowiedź do 20%. Badacze mogli również wykazać istotną korelację między odsetkiem odpowiedzi na leczenie a poziomem TMB u pacjentów leczonych anty-PD-1 lub anit-PD-L1 (rodzaje ICI). Ponadto doniesiono, że gdy ICI były jedynymi metodami leczenia stosowanymi przez pacjentów, 55% różnic w odsetku obiektywnych odpowiedzi w różnych typach nowotworów zostało wyjaśnionych przez TMB.
Rokowanie pacjenta
Zgłaszano powiązania między TMB a wynikami pacjentów w różnych nowotworach. W jednym badaniu naukowcy zaobserwowali różnice we wskaźnikach przeżycia , przy czym osoby z wysokim TMB miały medianę przeżycia wolnego od progresji wynoszącą 12,8 miesiąca i medianę przeżycia całkowitego nieosiągniętą do czasu publikacji, w porównaniu z odpowiednio 3,3 miesiąca i 16,3 miesiąca dla osób z niższym TMB. W innym badaniu oceniającym pacjentów, którzy nie otrzymali terapii ICI, stwierdzono, że pośrednie poziomy TMB (>5 i <20 mutacji/Mb) korelują ze znacznie zmniejszonym przeżyciem , prawdopodobnie w wyniku kumulacji mutacji w onkogeny . Zależność ta nie wydaje się być znacząco rozbieżna w różnych typach tkanek i tylko nieznacznie wpływa na nią korekta czynników zakłócających, takich jak palenie, płeć, wiek i pochodzenie etniczne. Sugeruje to, że TMB jest zarówno niezależnym, jak i wiarygodnym wskaźnikiem słabych wyników pacjentów w przypadku braku terapii ICI. Co ciekawe, odnotowano, że bardzo wysokie poziomy TMB (≥ 50 mutacji/Mb) korelują ze zwiększonym przeżyciem , nadając trendowi ogólny paraboliczny kształt. Chociaż związek ten jest nadal badany, wysunięto hipotezę, że zmniejszone ryzyko śmierci przy bardzo wysokim TMB może wynikać ze zmniejszonej żywotności komórek z powodu niestabilności genetycznej lub zwiększonej produkcji neoantygenów rozpoznawanych przez układ odpornościowy.
TMB w różnych nowotworach
Istnieje duże zróżnicowanie wartości TMB w różnych typach nowotworów, ponieważ liczba mutacji somatycznych może obejmować od 0,01 do 400 mutacji na megabazę genomu. Wykazano, że czerniak , NSCLC i inne raki płaskonabłonkowe mają najwyższe poziomy TMB w tej kolejności, podczas gdy białaczki i nowotwory dziecięce mają najniższe poziomy TMB i inne nowotwory, takie jak piersi , nerki i jajnika mają pośrednie wartości TMB. Istnieje również zmienność TMB w różnych podtypach różnych nowotworów. Ze względu na dużą zmienność TMB w różnych typach i podtypach raka, ważne jest zdefiniowanie różnych wartości odcięcia, aby uzyskać lepszą prognozę przeżycia i lepszą decyzję dotyczącą leczenia. Na przykład Fernandez i in. wykazało, że TMB może wahać się od 0,03 do 14,13 mutacji na megazasadę (średnia = 1,23) w kohorcie raka prostaty TCGA , podczas gdy ten zakres wynosi od 0,04-99,68 mutacji na megazasadę (średnia = 6,92) w TCGA kohorta raka pęcherza moczowego. Niedawne badanie wykazało, że dla różnych typów raka potrzebne są różne punkty odcięcia, aby znaleźć pacjentów, którzy mogą odnieść korzyści z terapii ICI. Ponadto kluczowe znaczenie ma zrozumienie, że zwykle w guzie występują różne skupiska komórek, znane jako heterogeniczność guza , które mogą wpływać na TMB, aw konsekwencji na odpowiedź na ICI. Innym czynnikiem, który może wpływać na TMB, jest to, czy źródłem próbki jest tkanka pierwotna, czy przerzutowa . Najbardziej przerzutowe wykazano, że próbki są monoklonalne (tj. w guzie występuje tylko jedno skupisko komórek), podczas gdy guzy pierwotne zwykle składają się z większej liczby skupisk i mają większą ogólną różnorodność genetyczną (bardziej heterogeniczne). Naukowcy wykazali, że przerzutowe mają zwykle wyższy poziom TMB w porównaniu z guzami pierwotnymi, co może wynikać z monoklonalnego charakteru zmian przerzutowych .
Obliczenie TMB
Istnieją rozbieżności między sposobem obliczania TMB w warunkach klinicznych i badawczych. Ogólnie rzecz biorąc, sekwencjonowanie całego genomu , sekwencjonowanie całego egzomu i podejścia oparte na panelach mogą być wykorzystane do obliczenia TMB. Badania TMB z perspektywy badawczej zazwyczaj obejmują sekwencjonowanie całego egzomu , a czasami sekwencjonowanie całego genomu w swoich przepływach pracy, podczas gdy aplikacje kliniczne wykorzystują sekwencjonowanie paneli do oszacowania TMB przede wszystkim ze względu na ich stosunkowo większą szybkość i niski koszt. W ramach podejść opartych na panelach przyjęto różne strategie obliczania TMB. Weźmy na przykład MSK-IMPACT opracowany przez Memorial Sloan Kettering Cancer Center i F1CDx opracowany przez Foundation Medicine . F1CDx wykorzystuje strategię sekwencjonowania wyłącznie guza, podczas gdy MSK-IMPACT wymaga sekwencjonowania zarówno guza, jak i jego dopasowanej normalnej próbki. Ponadto F1CDx zlicza mutacje synonimiczne, wykluczając mutacje sterowników hotspotów. MSK-IMPACT oblicza TMB z podobnymi kryteriami filtrowania jak te stosowane w sekwencjonowaniu całych egzomów , biorąc pod uwagę zarówno mutacje synonimiczne , jak i mutacje kierujące punktami aktywnymi . Zespoły docelowych paneli i sekwencjonowanie całego egzomu dla uzyskania optymalnych rezultatów zalecane są panele. Jako podejście, które jest potencjalnie bardziej celowe i opłacalne niż sekwencjonowanie, TMB można obliczyć bezpośrednio z obrazów patologii barwionych H&E przy użyciu głębokiego uczenia się .
Czynniki wpływające na obliczenie TMB
Ogólnie zidentyfikowano 5 głównych czynników wpływających na obliczenia TMB.
Zawartość komórek nowotworowych i zasięg sekwencjonowania
Większa zawartość komórek nowotworowych i zasięg sekwencjonowania odgrywają kluczową rolę w jakości danych TMB. Na przykład ukierunkowane panele mogą umożliwić głębsze sekwencjonowanie w porównaniu z sekwencjonowaniem całego egzomu , umożliwiając wyższą czułość, która, jak wykazano, działa dobrze, nawet gdy zawartość komórek nowotworowych jest niska (zdefiniowana jako <10%). Wykazano, że ukierunkowane panele umożliwiają znacznie większy zasięg niż sekwencjonowanie całego egzomu . Na przykład jedno z ostatnich badań osiągnęło średni zasięg sekwencjonowania we wszystkich próbkach guza wynoszący 744 × przy użyciu panelu MSK-IMPACT, podczas gdy WES doprowadził do średniego pokrycia celu wynoszącego 232 × w sekwencjach guza.
Wstępne przetwarzanie tkanek
Zazwyczaj tkanki guza utrwala się w formalinie, aby zachować morfologię tkanki i komórki w protokołach utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE). Chociaż FFPE oferuje opłacalną metodę przechowywania tkanek przez długi czas, należy wziąć pod uwagę ograniczenia dotyczące wpływu tej metody na obliczenia TMB. Jednym z ograniczeń tej metody jest to, że indukuje ona powstawanie różnych wiązań poprzecznych, w wyniku których nici DNA wiążą się ze sobą kowalencyjnie, co w konsekwencji może prowadzić do deaminacji zasad cytozynowych. Deaminacja cytozyny jest główną przyczyną szumu linii podstawowej w sekwencjonowaniu nowej generacji , co prowadzi do najbardziej rozpowszechnionych artefaktów sekwencji w FFPE (C: G > T: A). Może to generować artefakty, które należy usunąć w dalszym rurociągu.
Strategia sekwencjonowania
Różne strategie sekwencjonowania umożliwiają uwzględnienie różnej liczby genów w obliczeniach TMB (z podejściami WGS i WES umożliwiającymi analizę większej liczby genów). Podczas gdy podejścia oparte na panelach analizują stosunkowo mniej genów niż inne strategie, jedną z zalet sekwencjonowania opartego na panelach jest to, że interesujące geny można objąć znacznie większą głębokością sekwencjonowania i można ewentualnie zidentyfikować rzadkie warianty. Rozmiary paneli różnią się w panelach z 468 genami w panelu MSK-IMPACT, 315 genami w panelu Foundation Medicine i 409 genami w panelu Life Technologies. Ponieważ rozmiary paneli są mniejsze, niepewność związana z oszacowaniem TMB staje się większa, a współczynnik wariancji gwałtownie rośnie, gdy rozmiar docelowych paneli jest mniejszy niż 1 Mb.
rurociąg bioinformatyczny
W większości obliczeń TMB odfiltrowuje się warianty synonimiczne i warianty linii zarodkowej, ponieważ jest mało prawdopodobne, aby były bezpośrednio zaangażowane w tworzenie neoantygenów. Jednak niektóre potoki zachowują synonimiczne warianty . Aby uwzględnić warianty linii zarodkowej, idealnie byłoby przeprowadzić sekwencjonowanie na dopasowanej próbce nienowotworowej od każdego pacjenta. Jednak w praktyce klinicznej dostępność tej dopasowanej próbki może się różnić w różnych instytucjach i różnych czynnikach organizacyjnych, a niedostępność danych może utrudniać filtrowanie wariantów linii zarodkowych. Wybór wariantów wywołujących i innego oprogramowania w dalszych analizach może również wpływać na sposób ostatecznego obliczania TMB. TMB można obliczyć bezpośrednio z obrazów histopatologicznych przy użyciu wieloskalowego potoku głębokiego uczenia, unikając potrzeby sekwencjonowania i wywoływania wariantów.
Odcięcia
W różnych badaniach wyznaczono różne wartości graniczne w celu określenia wysokiego i niskiego statusu TMB. W płucach mediana TMB w ponad 18 000 przypadków raka płuc wynosiła 7,2 mutacji/Mb, przy czym około 12% pacjentów wykazało ponad 20 mutacji/Mb. Autorzy zidentyfikowali obciążenie mutacyjne nowotworu większe lub równe 10 mutacji/Mb jako optymalny punkt odcięcia dla korzyści z immunoterapii skojarzonej . Jednak w innych typach nowotworów wysoki status TMB został sklasyfikowany jako >20 mutacji/Mb.
Problemy i przyszłe kierunki
Jednym z zatwierdzonych biomarkerów terapii ICI jest ekspresja PD-L1 , ale na moc predykcyjną tego biomarkera wpływają takie czynniki, jak interpretacja testu i brak standardowych metod. Na TMB mają również wpływ te czynniki, oprócz problemów z dostępnością. Czynniki biologiczne, takie jak typ próbki i nowotworu , a także czynniki techniczne, takie jak technologia sekwencjonowania, mogą wpływać na ocenę TMB. Dlatego konieczne jest ujednolicenie metod ewaluacji, a wciąż istnieje tak wiele czynników, które mogą to zadanie skomplikować. Na przykład fuzje genów i zmiany potranslacyjne w białkach przyczyniają się do zachowania guza, aw konsekwencji do odpowiedzi na terapię, podczas gdy czynniki te nie są brane pod uwagę w szacowaniu TMB. Ponadto obecnie wszystkie mutacje mają taką samą wagę w obliczeniach TMB, podczas gdy mogą mieć bardzo różny wpływ na białek i szlaków . Ponadto nadal nie ma dobrej odpowiedzi na pytanie, w jaki sposób mutacje w genach o których wiadomo, że wpływają na terapię ICI, należy uwzględnić w ocenie TMB. Należy również zauważyć, że TMB jest bardzo zmienny w zależności od rodzaju i podtypu raka i prowadzone są różne badania w celu znalezienia różnych progów TMB.
Niektóre badania dowodzą, że aby lepiej przewidywać odpowiedź na terapię ICI, TMB powinno być stosowane jako marker uzupełniający z innymi biomarkerami, takimi jak PD-L1 . Inne badania wykazały, że połączenie ładunku TMB i neoantygenu może być stosowane jako biomarker do przewidywania przeżycia u pacjentów z czerniakiem , którzy otrzymali adaptacyjną terapię transferu komórek T. Ponieważ TMB jest stosunkowo nowym biomarkerem, nadal istnieje potrzeba przeprowadzenia większej liczby badań, a wiele laboratoriów koncentruje się na różnych aspektach tego biomarkera.