Sieciowa immunoprecypitacja

Sieciowanie i immunoprecypitacja ( CLIP lub CLIP-seq ) to metoda stosowana w biologii molekularnej , która łączy sieciowanie UV z immunoprecypitacją w celu identyfikacji miejsc wiązania RNA białek w skali transkryptomu, zwiększając w ten sposób naszą wiedzę na temat procesów potranskrypcyjnych sieci regulacyjne. CLIP może być stosowany albo z przeciwciałami przeciwko endogennym białkom, albo ze zwykłymi znacznikami peptydowymi (w tym FLAG, V5, HA i inne) lub oczyszczaniem powinowactwa, co umożliwia profilowanie organizmów modelowych lub RBP pozbawionych odpowiednich przeciwciał.

Przepływ pracy

Podstawowa zasada CLIP

CLIP rozpoczyna się od sieciowania in vivo kompleksów RNA-białko przy użyciu światła ultrafioletowego (UV). Po ekspozycji na promieniowanie UV tworzą się wiązania kowalencyjne między białkami i kwasami nukleinowymi, które znajdują się w bliskiej odległości (w odstępach rzędu angstremów). Następnie usieciowane komórki poddaje się lizie, fragmentacji RNA i izolowaniu białka będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą immunoprecypitacji. W celu umożliwienia primingu odwrotnej transkrypcji adaptery RNA są ligowane na końcach 3', a fragmenty RNA znakowane w celu umożliwienia analizy kompleksów RNA-białko po ich oddzieleniu od wolnego RNA za pomocą elektroforezy żelowej i transferu membranowego. proteinazą K w celu usunięcia białka z usieciowanego RNA, co pozostawia kilka aminokwasów w miejscu usieciowania. Często prowadzi to do obcięcia cDNA w usieciowanym nukleotydzie, co jest wykorzystywane w wariantach, takich jak iCLIP , w celu zwiększenia rozdzielczości metody. cDNA jest następnie syntetyzowany za pomocą RT-PCR, a następnie wysokoprzepustowe sekwencjonowanie, po którym następuje mapowanie odczytów z powrotem do transkryptomu i inne analizy obliczeniowe w celu zbadania miejsc interakcji.

Historia i zastosowania

Projekt CLIP pierwotnie podjęto w celu zbadania interakcji między specyficznym dla neuronów białkiem wiążącym RNA a czynnikami splicingowymi NOVA1 i NOVA2 w mózgu myszy , identyfikując miejsca wiązania RNA, które zawierały oczekiwane motywy wiążące Nova. Sekwencjonowanie biblioteki cDNA zidentyfikowało wiele pozycji zbliżonych do alternatywnych eksonów, z których kilka wymagało Nova1/2 do ich specyficznych dla mózgu wzorców splicingu. W 2008 r. CLIP połączono z wysokowydajnym sekwencjonowaniem (określanym jako „HITS-CLIP”) w celu wygenerowania map interakcji białko-RNA obejmujących cały genom dla Nova; od tego czasu za pomocą CLIP badano szereg innych białek wiążących RNA, w tym PTBP1, RbFox2 (gdzie określano je jako „CLIP-seq”), SFRS1, Argonaute, hnRNP C, białko upośledzenia umysłowego Fragile-X FMRP, Ptbp2 (w mózgu myszy), Mbnl2, białka nElavl (białka Hu specyficzne dla neuronów) i zastosowano do białek wiążących RNA ze wszystkich królestw życia, w tym prokariotów. Analiza CLIP białka wiążącego RNA Argonaute doprowadziła do identyfikacji docelowych mikroRNA poprzez dekodowanie map interakcji mikroRNA -mRNA i białko-RNA w mózgu myszy, a następnie w pączkujących drożdżach ( Saccharomyces cerevisiae ) , Caenorhabditis elegans , zarodkowych komórkach macierzystych i komórkach hodowli tkankowej .

Metody

HITS-CLIP

HITS-CLIP

HITS-CLIP łączy sieciowanie UV i immunoprecypitację z wysokowydajnym sekwencjonowaniem w celu identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących RNA. W projekcie HITS-CLIP wprowadzono również dodanie dinukleotydowych kodów kreskowych do starterów, zapewniając możliwość sekwencjonowania, a następnie dekonwolucji wielu eksperymentów jednocześnie. Dzięki analizie miejsc mutacji wywołanych sieciowaniem (CIMS) na dużych głębokościach sekwencjonowania , miejsca sieciowania można odróżnić od innych źródeł zmienności sekwencji.

PAR-CLIP

PAR-CLIP

PAR-CLIP (fotoaktywowalne sieciowanie i immunoprecypitacja wzmocnione rybonukleozydem) jest również używany do identyfikacji miejsc wiązania komórkowych białek wiążących RNA (RBP) i kompleksów rybonukleoproteinowych zawierających mikroRNA (miRNP). Metoda polega na włączeniu fotoreaktywnych analogów rybonukleozydów, takich jak 4-tiourydyna (4-SU) i 6-tioguanozyna (6-SG) do powstających transkryptów RNA przez żywe komórki. Napromienianie komórek światłem UV o długości fali 365 nm indukuje wydajne sieciowanie fotoreaktywnych komórkowych RNA znakowanych nukleozydami do oddziałujących RBP. Po immunoprecypitacji interesującego RBP następuje izolacja usieciowanego i koimmunoprecypitowanego RNA. Wyizolowany RNA jest przekształcany w bibliotekę cDNA i głęboko sekwencjonowany przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości . Sieciowanie analogów 4-SU i 6-SG skutkuje odpowiednio przejściem tymidyny do cytydyny i guanozyny do adenozyny. W rezultacie PAR-CLIP może z dużą dokładnością identyfikować miejsca wiązania.

Jednak PAR-CLIP ogranicza się głównie do hodowanych komórek, a cytotoksyczność nukleozydów jest problemem; doniesiono, że 4-SU hamuje syntezę rybosomalnego RNA, indukuje odpowiedź na stres jąderkowy i zmniejsza proliferację komórek. Metoda PAR-CLIP została wykorzystana do określenia w wysokiej rozdzielczości miejsc wiązania obejmujących cały transkryptom kilku znanych RBP i kompleksów rybonukleoproteinowych zawierających mikroRNA. Obejmuje to miRNA ukierunkowane na białka AGO i TNRC6.

iCLIP

iCLIP

iCLIP (sieciowanie z rozdzielczością poszczególnych nukleotydów i immunoprecypitacja) to wariant CLIP, który umożliwia amplifikację obciętych cDNA, które są wytwarzane, gdy odwrotna transkrypcja zatrzymuje się przedwcześnie w miejscu sieciowania. Inne podejścia do identyfikacji miejsc sieciowania białko-RNA obejmują analizę mutacji odczytanych cDNA, takich jak przejścia nukleotydów w PAR-CLIP lub rzadkie błędy wprowadzane przez odwrotną transkryptazę, gdy odczytuje miejsca sieciowania w standardowych metodach HITS-CLIP , określanych jako Crosslink analiza miejsc mutacji indukowanych (CIMS).

iCLIP dodał również losową sekwencję (unikalny identyfikator molekularny, UMI ) wraz z eksperymentalnymi kodami kreskowymi do startera używanego do odwrotnej transkrypcji, kodując w ten sposób unikalne cDNA, aby zminimalizować wszelkie błędy lub odchylenia ilościowe PCR, a tym samym poprawić ilościową ocenę zdarzeń wiązania. Umożliwienie amplifikacji obciętych cDNA doprowadziło do zidentyfikowania miejsc interakcji RNA-białko w wysokiej rozdzielczości poprzez analizę pozycji początkowej obciętych cDNA, a także ich dokładną ocenę ilościową za pomocą UMI z oprogramowaniem o nazwie "iCount " . Te innowacje iCLIP zostały przyjęte przez późniejsze warianty CLIP, takie jak eCLIP i irCLIP. Inna modyfikacja iCLIP, miCLIP, identyfikuje metylowane miejsca RNA za pomocą zmutowanego enzymu lub przeciwciała specyficznego dla modyfikacji. Ilościowy charakter iCLIP umożliwił porównanie próbek na poziomie pełnych RNA lub zbadanie konkurencyjnego wiązania wielu białek wiążących RNA lub subtelnych zmian w wiązaniu zmutowanego białka na poziomie pików wiązania.

eCLIP



eCLIP (ulepszone CrossLinking i ImmunoPrecipitation, a następnie sekwencjonowanie o dużej przepustowości) jest również wykorzystywane do mapowania miejsc wiązania RBP na całym transkryptomie RNA. eCLIP został zaprojektowany w celu ulepszenia iCLIP poprzez zwiększenie wydajności przekształcania oczyszczonych fragmentów RNA w bibliotekę cDNA. W swojej publikacji doniesiono, że eCLIP zwiększa taką wydajność ponad 1000-krotnie, co nie tylko zmniejsza zmarnowane sekwencjonowanie zduplikowanych cząsteczek PCR, ale także radykalnie zmniejsza niepowodzenia eksperymentalne podczas procedury CLIP. Ponadto amplifikacja w eCLIP jest teraz porównywalna z RNA-seq, umożliwiając rygorystyczną normalizację ilościową w stosunku do sparowanych kontroli wejściowych (w celu usunięcia tła w rybosomach i innych bardzo obfitych RNA), a także ilościowe porównanie pików i próbek, umożliwiając wykrywanie allelu -specyficzne wiązanie lub zróżnicowane wiązanie RNA między warunkami. Podobnie jak w innych metodach CLIP, eCLIP opiera się na interakcjach RBP-RNA połączonych kowalencyjnie za pomocą sieciowania żywych komórek UV. Komórki są następnie lizowane, a RNA fragmentowany przy użyciu ograniczonej obróbki RNazą. Specyficzny RBP (i związany z nim RNA) jest następnie poddawany immunoprecypitacji przy użyciu przeciwciała, które specyficznie rozpoznaje docelowy RBP. Po ligacji adaptera 3' RNA, immunoprecypitowany materiał (jak również sparowaną próbkę wejściową) przepuszcza się na denaturujące żele białkowe i przenosi na membrany nitrocelulozowe. Region od wielkości białka do 75 kDa powyżej wycina się z błony i traktuje proteinazą K w celu uwolnienia RNA. Po oczyszczeniu RNA jest następnie poddawane odwrotnej transkrypcji do ssDNA, kiedy drugi adapter jest poddawany ligacji. Łącząc drugi adapter z cDNA, eCLIP może identyfikować obcięte cDNA, podobnie jak iCLIP, a tym samym badać miejsca interakcji RNA-białko z dużą rozdzielczością. Następnie stosuje się amplifikację PCR w celu uzyskania wystarczającej ilości materiału do sekwencjonowania o dużej przepustowości. eCLIP można również wykorzystać do identyfikacji celów miRNA i profilowania modyfikacji RNA, takich jak m6A. Zestawy danych eCLIP zostały utworzone dla ponad 150 RBP z zatwierdzonymi, dostępnymi na rynku przeciwciałami.

Inne metody CLIP

sCLIP (prosty CLIP) to technika, która wymaga mniejszych ilości wejściowego RNA i pomija radioznakowanie immunoprecypitowanego RNA. Metoda opiera się na liniowej amplifikacji immunoprecypitowanego RNA, a tym samym poprawia złożoność biblioteki sekwencjonowania pomimo znacznego zmniejszenia ilości materiału wejściowego i pominięcia kilku etapów oczyszczania. Ponadto umożliwia wizualizację immunoprecypitowanego RNA bez znakowania radioaktywnego przy użyciu wysoce czułej techniki znakowania opartej na biotynie. Wraz z platformą bioinformatyczną metoda ta ma zapewnić głęboki wgląd w interakcje RNA-białko w naukach biomedycznych, gdzie ilość materiału wyjściowego jest często ograniczona (np. w przypadku cennych próbek klinicznych).

Jako modyfikację CLIP zidentyfikowano metylowane miejsca RNA przy użyciu zmutowanego enzymu lub przeciwciała specyficznego dla modyfikacji metodami określanymi jako miCLIP lub m6A-CLIP.

Zalety i ograniczenia

Zalety

Białka wiążące RNA są często składnikami kompleksów wielobiałkowych, a RNA z różnych genów jest obecne w komórkach w różnych ilościach, dlatego często można izolować RNA związane z wspólnie oczyszczonymi białkami lub nieswoiście przylegające do kulek podczas immunoprecypitacji określonego białka. Wykazano , że specyficzność danych uzyskana przy użyciu wczesnych metod immunoprecypitacji, takich jak RIP , zależy od warunków reakcji eksperymentu, takich jak stężenia białek i warunki jonowe, a ponowne połączenie białek wiążących RNA po lizie komórek może prowadzić do wykrycia sztucznych interakcji . Metody sieciowania formaldehydem zostały wykorzystane do zachowania interakcji RNA-białko, ale generują one również wiązania poprzeczne białko-białko. Wykorzystując sieciowanie UV, które jest specyficzne dla bezpośrednich kontaktów białko-RNA, CLIP unika wiązań krzyżowych białko-białko i zapewnia wysoką specyficzność, jednocześnie uzyskując informacje o położeniu w miejscach interakcji białko-RNA.

Ponieważ sieciowanie UV tworzy wiązanie kowalencyjne, usieciowane fragmenty RNA zachowują krótki peptyd po trawieniu proteinazą K, co można wykorzystać do identyfikacji miejsca sieciowania. Odwrotna transkrypcja najczęściej obcina się w miejscach sieciowania, tworząc skrócone cDNA, które są wykorzystywane przez iCLIP, podczas gdy odczytywane cDNA często zawierają mutacje w miejscu sieciowania (patrz HITS-CLIP i PAR-CLIP).

Ograniczenia

Podsumowanie KLIPU

Wszystkie protokoły generowania bibliotek CLIP wymagają umiarkowanych ilości komórek lub tkanek (50–100 mg), wielu etapów enzymatycznych i dostosowanych analiz obliczeniowych. Niektóre kroki są trudne do zoptymalizowania i często mają niską wydajność. Na przykład nadmierne trawienie RNazą może zmniejszyć liczbę zidentyfikowanych miejsc wiązania, dlatego należy je zoptymalizować. Skuteczność sieciowania różni się również w zależności od białek, a nukleotydowe obciążenie sieciowania zostało zgłoszone, na przykład przez porównanie miejsc sieciowania i motywów wzbogaconych, gdy kompleksy białko-RNA są badane in vivo w żywych komórkach i in vitro , chociaż opracowywane są metody minimalizujące takie nastawienie do odkrywania wzbogaconego motywu. Obliczeniowo przewidywane cele miRNA pochodzące z TargetScan są porównywalne z CLIP w identyfikowaniu celów miRNA, co rodzi pytania o ich użyteczność w porównaniu z istniejącymi przewidywaniami. Ponieważ metody CLIP opierają się na immunoprecypitacji, usieciowany RNA może w niektórych przypadkach wpływać na interakcje przeciwciało-epitop. Zaobserwowano wreszcie znaczące różnice. Dlatego surowe wyniki CLIP wymagają dalszych analiz obliczeniowych, aby dokładnie zbadać interakcje miejsca wiązania RNA z białkiem w komórce.

Podobne metody

  • RIP-Chip bada wzbogacenie pełnego RNA po immunoprecypitacji określonego białka, a następnie analizie mikromacierzy, ale bez użycia sieciowania nie identyfikuje miejsc wiązania RNA
  • ChIP-Seq , metoda znajdowania interakcji z DNA, a nie z RNA
  • SELEX , metoda n vitro do znajdowania konsensusowej sekwencji wiążącej

Dalsza lektura

  • baza danych starBase : baza danych do eksploracji interakcji miRNA-lncRNA, miRNA-mRNA, miRNA-sncRNA, miRNA-circRNA, protein-lncRNA, protein-RNA i sieci ceRNA z PAR-CLIP ( CLIP-Seq , HITS-CLIP , iCLIP , CLASH ) oraz miejsca docelowe mikroRNA TargetScan , PicTar, RNA22, miRanda i PITA .
  • Baza danych BIMSB doRiNA : baza danych do badania interakcji białko-RNA i mikroRNA-cel na podstawie danych CLIP-Seq , HITS-CLIP , PAR-CLIP , iCLIP i przewidywań docelowych miejsc mikroRNA PICTAR.
  • miRTarCLIP : Obliczeniowe podejście do identyfikacji interakcji mikroRNA-cel przy użyciu wysokowydajnego sekwencjonowania CLIP i PAR-CLIP .
  • clipz : potok do analizy krótkich odczytów RNA z eksperymentów HITS-CLIP.
  • dCLIP : dCLIP to program Perla do odkrywania zróżnicowanych regionów wiążących w dwóch porównawczych eksperymentach CLIP-Seq (HITS-CLIP, PAR-CLIP lub iCLIP).

Źródła

Pobrane z „ https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Cross-linking_immunoprecipitation&oldid=1140860343 ”