Terapia genowa ludzkiej siatkówki
Terapia genowa siatkówki jest obiecująca w leczeniu różnych form niedziedzicznej i dziedzicznej ślepoty .
W 2008 roku trzy niezależne grupy badawcze poinformowały, że pacjenci z rzadką genetyczną chorobą siatkówki, wrodzoną ślepotą Lebera, byli skutecznie leczeni za pomocą terapii genowej wirusem związanym z adenowirusami (AAV). We wszystkich trzech badaniach wykorzystano wektor AAV do dostarczenia funkcjonalnej kopii genu RPE65, który przywracał wzrok u dzieci cierpiących na LCA. Wyniki te były powszechnie postrzegane jako sukces w dziedzinie terapii genowej i wywołały podekscytowanie i rozpęd dla zastosowań, w których pośredniczy AAV w chorobach siatkówki.
W terapii genowej siatkówki najczęściej stosowane wektory do dostarczania genów do oka są oparte na wirusie związanym z adenowirusami . Wielką zaletą stosowania wirusa związanego z adenowirusem do terapii genowej jest to, że wywołuje on minimalne odpowiedzi immunologiczne i pośredniczy w długoterminowej ekspresji transgenu w różnych typach komórek siatkówki. Na przykład ścisłe połączenia, które tworzą barierę krew-siatkówka, oddzielają przestrzeń podsiatkówkową od dopływu krwi , zapewniając ochronę przed drobnoustrojami i zmniejszając większość uszkodzeń o podłożu immunologicznym.
Wciąż brakuje wiedzy na temat dystrofii siatkówki. Szczegółowa charakterystyka jest potrzebna w celu poprawy wiedzy. Aby rozwiązać ten problem, tworzenie rejestrów jest próbą pogrupowania i scharakteryzowania rzadkich chorób. Rejestry pomagają zlokalizować i zmierzyć wszystkie fenotypy tych chorób, a tym samym zapewnić łatwe obserwacje i źródło informacji dla społeczności naukowców. Projekty rejestrów różnią się w zależności od regionu, jednak lokalizacja i charakterystyka fenotypu są standardowym złotem. Przykładami rejestrów są: RetMxMap . Meksykański i latynoamerykański rejestr tworzony od 2009 roku. Ten rejestr został stworzony przez dr Addę Lízbeth Villanueva Avilés. Jest naukowcem klinicznym zajmującym się mapowaniem genów dziedzicznych dystrofii siatkówki w Meksyku i innych krajach łacińskich.
Badania kliniczne
Wrodzona ślepota Lebera
Badania przedkliniczne na mysich modelach wrodzonej ślepoty Lebera (LCA) zostały opublikowane w 1996 r., A badanie na psach w 2001 r. W 2008 r. trzy grupy zgłosiły wyniki badań klinicznych z użyciem wirusa związanego z adenowirusami do LCA. W tych badaniach wektor AAV kodujący RPE65 został dostarczony poprzez „wstrzyknięcie podsiatkówkowe”, w ramach którego niewielka ilość płynu jest wstrzykiwana pod siatkówkę podczas krótkiego zabiegu chirurgicznego. Rozwój był kontynuowany, aw grudniu 2017 r. FDA zatwierdziła Voretigene neparvovec (Luxturna), terapię genową opartą na wektorze wirusów związanych z adenowirusami dla dzieci i dorosłych z biallelicznymi mutacjami genu RPE65 odpowiedzialnymi za dystrofię siatkówki, w tym wrodzoną ślepotę Lebera. Ludzie muszą mieć zdolne do życia komórki siatkówki, co jest warunkiem wstępnym podania leku do oka.
Po udanych próbach klinicznych w LCA naukowcy opracowali podobne metody leczenia przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem w leczeniu zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD). Do tej pory wysiłki koncentrowały się na długotrwałym dostarczaniu VEGF do leczenia wysiękowej postaci zwyrodnienia plamki żółtej. Podczas gdy wysiękową postać AMD leczy się obecnie za pomocą częstych wstrzyknięć rekombinowanego białka do gałki ocznej, celem takiego leczenia jest długoterminowe opanowanie choroby po jednorazowym podaniu. Jedno z takich badań jest prowadzone w Lions Eye Institute w Australii we współpracy z Avalanche Biotechnologies, start-upem biotechnologicznym z siedzibą w USA. Kolejne badanie na wczesnym etapie jest sponsorowane przez firmę Genzyme Corporation .
Choroideremia
W październiku 2011 roku ogłoszono pierwsze badanie kliniczne dotyczące leczenia choroideremii . Dr Robert MacLaren z University of Oxford, który prowadził badanie, wspólnie opracował leczenie z dr Miguelem Seabrą z Imperial College w Londynie. W tym badaniu fazy 1/2 zastosowano podsiatkówkowe AAV w celu przywrócenia genu REP u pacjentów dotkniętych chorobą. Wstępne wyniki badania zostały zgłoszone w styczniu 2014 roku jako obiecujące, ponieważ wszyscy szóstka pacjentów miała lepszy wzrok.
Ślepota barw
Ostatnie badania wykazały, że AAV może z powodzeniem przywrócić widzenie kolorów w leczeniu ślepoty barw u dorosłych małp. Chociaż to leczenie nie weszło jeszcze do badań klinicznych na ludziach, praca ta została uznana za przełom w zakresie możliwości celowania w fotoreceptory czopków.
Mechanizm
Komponenty fizjologiczne w terapii genowej siatkówki
Siatkówka nerwowa kręgowców składa się z kilku warstw i różnych typów komórek (patrz anatomia siatkówki człowieka ). Szereg tych typów komórek bierze udział w chorobach siatkówki, w tym komórki zwojowe siatkówki , które ulegają degeneracji w jaskrze, fotoreceptory pręcików i czopków , które reagują na światło i ulegają degeneracji w zwyrodnieniu barwnikowym siatkówki , zwyrodnieniu plamki żółtej i innych chorobach siatkówki oraz nabłonek barwnikowy (RPE), który wspiera fotoreceptory i jest również zaangażowany w barwnikowe zwyrodnienie siatkówki i zwyrodnienie plamki żółtej .
W terapii genowej siatkówki AAV jest zdolny do „transdukcji” tych różnych typów komórek poprzez wejście do komórek i ekspresję terapeutycznej sekwencji DNA. Ponieważ komórki siatkówki nie dzielą się, AAV nadal utrzymuje się i zapewnia ekspresję terapeutycznej sekwencji DNA przez długi okres czasu, który może trwać kilka lat.
Tropizm AAV i drogi podania
AAV jest zdolny do transdukcji wielu typów komórek w siatkówce. Serotyp 2 AAV, najlepiej zbadany typ AAV, jest powszechnie podawany jedną z dwóch dróg: doszklistkowo lub podsiatkówkowo. Drogą do ciała szklistego AAV wstrzykuje się do ciała szklistego oka. Drogą podsiatkówkową AAV wstrzykuje się pod siatkówkę, wykorzystując potencjalną przestrzeń między fotoreceptorami a warstwą RPE, w krótkim zabiegu chirurgicznym. Chociaż jest to bardziej inwazyjne niż droga doszklistkowa, płyn jest wchłaniany przez RPE, a siatkówka spłaszcza się w mniej niż 14 godzin bez powikłań. Doszklistkowe AAV celuje w komórki zwojowe siatkówki i kilka komórek glejowych Mullera. Podsiatkówkowy AAV skutecznie celuje w fotoreceptory i komórki RPE.
Powodem, dla którego różne drogi podawania prowadzą do transfekcji różnych typów komórek (np. różne tropizmy ) jest to, że wewnętrzna błona ograniczająca (ILM) i różne warstwy siatkówki działają jak fizyczne bariery dla dostarczania leków i wektorów do głębszych warstw siatkówki . Tak więc, ogólnie rzecz biorąc, podsiatkówkowe AAV jest 5-10 razy skuteczniejsze niż podawanie drogą doszklistkową.
Modyfikacja tropizmu i nowe wektory AAV
Jednym z ważnych czynników dostarczania genów jest rozwój zmienionych tropizmów komórkowych w celu zawężenia lub poszerzenia dostarczania genów za pośrednictwem rAAV i zwiększenia jego wydajności w tkankach. Specyficzne właściwości, takie jak konformacja kapsydu, strategie kierowania do komórek, mogą określić, które typy komórek są dotknięte, a także wydajność procesu transferu genów . Można podejmować różne rodzaje modyfikacji. Na przykład modyfikacja przez zmiany chemiczne, immunologiczne lub genetyczne, które umożliwiają interakcję kapsydu AAV2 z określonymi cząsteczkami powierzchni komórki .
Wstępne badania AAV w siatkówce wykorzystywały serotyp 2 AAV. Naukowcy zaczynają obecnie opracowywać nowe warianty AAV, oparte na naturalnie występujących serotypach AAV i zmodyfikowanych wariantach AAV.
Wyizolowano kilka naturalnie występujących serotypów AAV, które mogą transdukować komórki siatkówki. Po wstrzyknięciu do ciała szklistego tylko serotypy 2 i 8 AAV były zdolne do transdukcji komórek zwojowych siatkówki. Sporadycznie komórki Mullera transdukowano serotypami 2, 8 i 9 AAV. Po wstrzyknięciu podsiatkówkowym serotypy 2, 5, 7 i 8 skutecznie transdukowały fotoreceptory, a serotypy 1, 2, 5, 7, 8 i 9 skutecznie transdukowały komórki RPE .
Niedawno opisano jeden przykład zmodyfikowanego wariantu, który skutecznie transdukuje glej Mullera po wstrzyknięciu do ciała szklistego i został użyty do uratowania zwierzęcego modelu agresywnego, autosomalnie dominującego barwnikowego zapalenia siatkówki .
AAV i przywilej immunologiczny w siatkówce
Co ważne, siatkówka jest uprzywilejowana immunologicznie, a zatem nie doświadcza znaczącego stanu zapalnego ani odpowiedzi immunologicznej po wstrzyknięciu AAV. Odpowiedź immunologiczna na wektory terapii genowej jest tym, co spowodowało niepowodzenie wcześniejszych prób terapii genowej i jest uważana za kluczową zaletę terapii genowej oka. Ponowne podanie było skuteczne u dużych zwierząt, co wskazuje, że nie rozwija się długotrwała odpowiedź immunologiczna.
Ostatnie dane wskazują, że droga podsiatkówkowa może podlegać większemu uprzywilejowaniu immunologicznemu w porównaniu z drogą doszklistkową.
Sekwencja promotora
Ekspresja w różnych typach komórek siatkówki może być określona przez sekwencję promotora. W celu ograniczenia ekspresji do określonego typu komórek można zastosować promotor specyficzny dla tkanki lub typu komórki.
Na przykład u szczurów mysi gen rodopsyny kieruje ekspresją w AAV2, produkt reporterowy GFP stwierdzono tylko w fotoreceptorach szczurów, a nie w żadnym innym typie komórek siatkówki lub w sąsiednim RPE po wstrzyknięciu podsiatkówkowym. Z drugiej strony, jeśli wszechobecna ekspresja wirusa cytomegalii (CMV) jest ekspresjonowana w wielu różnych typach transfekowanych komórek. Inne wszechobecne promotory, takie jak promotor CBA, fuzja promotora aktyny kurczaka i natychmiastowego wczesnego wzmacniacza CMV, umożliwiają stabilną ekspresję reportera GFP zarówno w komórkach RPE, jak i fotoreceptorach po wstrzyknięciach podsiatkówkowych.
Modulacja ekspresji
Czasami konieczna może być modulacja ekspresji transgenu, ponieważ silna konstytutywna ekspresja genu terapeutycznego w tkankach siatkówki może być szkodliwa dla długoterminowej funkcji siatkówki. Do modulacji ekspresji stosowano różne metody. Jednym ze sposobów jest użycie egzogennie regulowanego układu promotora w wektorach AAV. Na przykład tetracykliną wykorzystuje wyciszający/transaktywujący wektor AAV2 i oddzielne indukowalne jednoczesne wstrzyknięcie reagujące na doksycyklinę. Gdy indukcja następuje przez doustną doksycyklinę , system ten wykazuje ścisłą regulację ekspresji genów zarówno w komórkach fotoreceptorowych, jak i RPE.
Przykłady i modele zwierzęce
Kierowanie RPE
Jedno badanie przeprowadzone przez Royal College of Surgeons (RCS) na modelu szczurzym pokazuje, że mutacja recesywna w genie receptora kinazy tyrozynowej, mertk, skutkuje przedwczesnym kodonem stop i upośledzoną funkcją fagocytozy przez komórki RPE. Ta mutacja powoduje gromadzenie się szczątków segmentu zewnętrznego w przestrzeni podsiatkówkowej, co powoduje śmierć komórek fotoreceptorów . Organizm modelowy z tą chorobą otrzymał podsiatkówkową iniekcję serotypu 2 AAV niosącego mysi cDNA Mertk pod kontrolą promotorów CMV lub RPE65. Stwierdzono, że to leczenie przedłuża przeżycie komórek fotoreceptorów o kilka miesięcy, a także liczba fotoreceptorów była 2,5-krotnie wyższa w oczach leczonych AAV-Mertk w porównaniu z kontrolami 9 tygodni po wstrzyknięciu, a także stwierdzono zmniejszoną ilość zanieczyszczeń w przestrzeni podsiatkówkowej.
Białko RPE65 jest wykorzystywane w cyklu retinoidowym, w którym all-trans-retinol w zewnętrznym segmencie pręcika jest izomeryzowany do postaci 11-cis i utleniany do siatkówki 11-cis, zanim wróci do fotoreceptora i połączy się z cząsteczką opsyny , tworząc funkcjonalna rodopsyna . W zwierzęcym modelu nokautu (RPE65-/-), eksperyment z transferem genów pokazuje, że wczesne dostarczenie do oka ludzkiego wektora RPE65 w 14 dniu embrionalnym wykazuje wydajną transdukcję nabłonka barwnikowego siatkówki u myszy z nokautem RPE65-/- i ratuje funkcje wzrokowe. Pokazuje to, że skuteczną terapię genową można przypisać wczesnemu dostarczeniu do oka choremu zwierzęciu.
Celowanie w fotoreceptory
Młodzieńcza siatkówczak to choroba, która atakuje tkankę nerwową w oku. Choroba ta jest sprzężoną z chromosomem X recesywną chorobą zwyrodnieniową centralnego plamki żółtej i jest spowodowana mutacją w genie RSI kodującym białko retinoschizynę. Retinoschizyna jest wytwarzana w fotoreceptorze i komórkach dwubiegunowych i ma kluczowe znaczenie dla utrzymania integralności synaptycznej siatkówki.
Konkretnie, wektor AAV 5 zawierający cDNA ludzkiego RSI typu dzikiego kierowany przez mysi promotor opsyny wykazywał długoterminową odbudowę funkcjonalną i strukturalną siatkówki. Po leczeniu znacznie poprawiła się również niezawodność strukturalna siatkówki, charakteryzująca się wzrostem grubości zewnętrznej warstwy jądrowej .
Barwnikowe zwyrodnienie siatkówki
Barwnikowe zwyrodnienie siatkówki jest chorobą dziedziczną, która w wyniku obumierania komórek fotoreceptorów prowadzi do postępującej ślepoty nocnej i utraty widzenia peryferyjnego . Większość osób cierpiących na RP rodzi się z martwymi lub dysfunkcyjnymi pręcikami , więc w nocy są skutecznie ślepi, ponieważ są to komórki odpowiedzialne za widzenie przy słabym oświetleniu. Często następuje śmierć komórek czopków , odpowiedzialnych za widzenie kolorów i ostrość, przy poziomach światła obecnych w ciągu dnia. Utrata czopków prowadzi do całkowitej ślepoty już w wieku pięciu lat, ale może rozpocząć się dopiero wiele lat później. Istnieje wiele hipotez dotyczących tego, jak brak pręcików może prowadzić do śmierci czopków. Określenie mechanizmu RP jest trudne, ponieważ istnieje ponad 39 loci genetycznych i genów skorelowanych z tą chorobą. W celu znalezienia przyczyny RP zastosowano różne techniki terapii genowej, aby odnieść się do każdej z hipotez.
Różne rodzaje dziedziczenia mogą przypisywać tej chorobie; autosomalny recesywny, autosomalny dominujący, sprzężony z chromosomem X itp. Główną funkcją rodopsyny jest inicjowanie kaskady fototransdukcji . Białka opsyny są wytwarzane w wewnętrznych segmentach fotoreceptorów, następnie transportowane do segmentu zewnętrznego i ostatecznie fagocytowane przez komórki RPE. Kiedy mutacje występują w rodopsynie, wpływa to na kierunkowy ruch białek, ponieważ mutacje mogą wpływać na fałdowanie , stabilność i transport wewnątrzkomórkowy białek. Jednym ze sposobów jest wprowadzenie dostarczanych przez AAV rybozymów zaprojektowanych do celowania i niszczenia zmutowanego mRNA.
Sposób działania tego układu pokazano na modelu zwierzęcym ze zmutowanym genem rodopsyny. Wstrzyknięte rybozymy AAV zoptymalizowano in vitro i użyto do rozszczepienia transkryptu zmutowanego mRNA P23H (gdzie występuje większość mutacji) in vivo.
Inna mutacja w białku strukturalnym rodopsyny, w szczególności peryferynie 2, która jest glikoproteiną błonową zaangażowaną w tworzenie zewnętrznego segmentu dysku fotoreceptorów, może prowadzić do recesywnego RP i zwyrodnienia plamki żółtej u ludzi (19). W eksperymencie na myszach AAV2 niosący gen peryferyny 2 typu dzikiego kierowany przez promotor rodopsyny podano myszom przez wstrzyknięcie podsiatkówkowe. Wynik wykazał poprawę struktury i funkcji fotoreceptorów, co wykryto za pomocą ERG (elektroretinogram). Wynik wykazał poprawę struktury i funkcji fotoreceptorów, co zostało wykryte przez ERG. Również peryferynę 2 wykryto w zewnętrznej warstwie segmentu siatkówki 2 tygodnie po wstrzyknięciu, a efekty terapeutyczne odnotowano już po 3 tygodniach od wstrzyknięcia. Dobrze zdefiniowany segment zewnętrzny zawierający zarówno peryferynę2, jak i rodopsynę był obecny 9 miesięcy po wstrzyknięciu.
Ponieważ apoptoza może być przyczyną śmierci fotoreceptorów w większości dystrofii siatkówki. Wiadomo, że czynniki przeżycia i odczynniki antyapoptoiczne mogą być alternatywnym leczeniem, jeśli mutacja nie jest znana w terapii zastępczej genu. Niektórzy naukowcy eksperymentowali z leczeniem tego problemu poprzez wstrzykiwanie do oka zastępczych czynników troficznych. Jedna grupa naukowców wstrzyknęła białko czynnika żywotności stożka pochodzącego od pręcików (RdCVF) (kodowane przez gen Nxnl1 (Txnl6)) do oka najczęściej występujących modeli szczurów z dominującą mutacją RP. To leczenie wykazało sukces w promowaniu przetrwania aktywności czopków, ale leczenie jeszcze bardziej służyło zapobieganiu postępowi choroby poprzez zwiększenie faktycznej funkcji czopków. Przeprowadzono również eksperymenty w celu zbadania, czy dostarczanie wektorów AAV2 z cDNA dla komórek glejowych (GDNF) może mieć działanie przeciwapoptotyczne na pręciki . Patrząc na model zwierzęcy, transgen opsyny zawiera skrócone białko pozbawione ostatnich 15 aminokwasów C-końca, co powoduje zmiany w transporcie rodopsyny do segmentu zewnętrznego i prowadzi do zwyrodnienia siatkówki. Gdy wektor AAV2-CBA-GDNF jest podawany do przestrzeni podsiatkówkowej, fotoreceptory stabilizowały się, a fotoreceptory pręcików wzrastały, co było widoczne w poprawie funkcji analizy ERG. Przeprowadzono również udane eksperymenty na zwierzętach z użyciem rzęskowego czynnika neurotroficznego (CNTF), a CNTF jest obecnie stosowany jako lek w badaniach klinicznych na ludziach.
Leczenie oparte na AAV chorób neowaskularnych siatkówki
Neowaskularyzacja oka (NV) to nieprawidłowe tworzenie się nowych naczyń włosowatych z już istniejących naczyń krwionośnych w oku, co jest charakterystyczne dla chorób oczu, takich jak retinopatia cukrzycowa (DR), retinopatia wcześniaków (ROP) i (postać wysiękowa) starcza związane zwyrodnienie plamki żółtej (AMD). Jednym z głównych graczy w tych chorobach jest VEGF (czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego), o którym wiadomo, że indukuje przeciekanie naczyń i który jest również angiogenny. W prawidłowych tkankach VEGF stymuluje proliferację komórek śródbłonka w sposób zależny od dawki, ale aktywność ta jest tracona w przypadku innych czynników angiogennych.
Wykazano, że wiele czynników angiostatycznych przeciwdziała skutkom zwiększenia miejscowego VEGF. Wykazano, że naturalnie występująca postać rozpuszczalnego Flt-1 odwraca neowaskularyzację u szczurów, myszy i małp.
Czynnik pochodzenia nabłonka barwnikowego ( PEDF ) działa również jako inhibitor angiogenezy . Wydzielanie PEDF jest zauważalnie zmniejszone w warunkach niedotlenienia, umożliwiając dominację mitogennej aktywności śródbłonka VEGF, co sugeruje, że utrata PEDF odgrywa kluczową rolę w rozwoju NV wywołanej niedokrwieniem . Jedno odkrycie kliniczne pokazuje, że poziomy PEDF w cieczy wodnistej człowieka zmniejszają się wraz z wiekiem, co wskazuje, że zmniejszenie to może prowadzić do rozwoju AMD. W modelu zwierzęcym AAV z ludzkim cDNA PEDF pod kontrolą promotora CMV zapobiegał NV naczyniówki i siatkówki (24).
Odkrycie sugeruje, że ekspresję czynników angiostatycznych, w której pośredniczy AAV, można zastosować w leczeniu NV. Takie podejście może być przydatne jako alternatywa dla częstych wstrzyknięć rekombinowanego białka do oka. Ponadto PEDF i sFlt-1 mogą być zdolne do dyfuzji przez twardówki , co pozwala na względnie niezależną potencjalną niezależność od miejsca podania wewnątrzgałkowego.