Test komet

Zrzut ekranu aplikacji testu komet CaspLab

Test elektroforezy pojedynczej komórki w żelu ( SCGE , znany również jako test kometowy ) jest nieskomplikowaną i czułą techniką wykrywania uszkodzeń DNA na poziomie pojedynczej komórki eukariotycznej . Został po raz pierwszy opracowany przez Östlinga i Johanssona w 1984 roku, a później zmodyfikowany przez Singha i in. w 1988 r. Od tego czasu zyskała na popularności jako standardowa technika oceny uszkodzeń / naprawy DNA, biomonitoringu i testów genotoksyczności. Polega na zamknięciu komórek w zawiesinie agarozy o niskiej temperaturze topnienia, lizie komórek w warunkach obojętnych lub zasadowych (pH>13) oraz elektroforezie zawieszonych zlizowanych komórek. Termin „kometa” odnosi się do wzorca migracji DNA przez żel do elektroforezy, który często przypomina kometę.

Test kometowy (elektroforeza żelowa jednokomórkowa) to prosta metoda pomiaru pęknięć nici kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) w komórkach eukariotycznych. Komórki osadzone w agarozie na szkiełku mikroskopowym są poddawane lizie z użyciem detergentu i soli o wysokiej zawartości soli, tworząc nukleoidy zawierające superskręcone pętle DNA połączone z macierzą jądrową. Elektroforeza przy wysokim pH daje w wyniku struktury przypominające komety, obserwowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej; intensywność ogona komety w stosunku do głowy odzwierciedla liczbę pęknięć DNA. Prawdopodobną przyczyną tego jest to, że pętle zawierające przerwę tracą swoje superskręcenie i mogą swobodnie rozciągać się w kierunku anody. Następnie przeprowadza się analizę wizualną z barwieniem DNA i obliczaniem fluorescencji w celu określenia stopnia uszkodzenia DNA. Można to wykonać ręcznie lub automatycznie za pomocą oprogramowania do obrazowania.

Procedura

Kapsułkowanie

Próbkę komórek, pochodzących z hodowli komórkowej in vitro lub od osobnika badanego in vivo , dysperguje się w poszczególnych komórkach i zawiesza w stopionej agarozie o niskiej temperaturze topnienia w temperaturze 37 °C. Ta mono-zawiesina jest odlewana na szkiełku mikroskopowym . Szklane szkiełko nakrywkowe jest trzymane pod kątem, a pojedyncza zawiesina jest nakładana na punkt styku szkiełka nakrywkowego ze szkiełkiem. Gdy szkiełko nakrywkowe jest opuszczane na szkiełko, stopiona agaroza rozprzestrzenia się, tworząc cienką warstwę. Agaroza jest żelowana w temperaturze 4°C i usuwane jest szkiełko nakrywkowe.

Agaroza tworzy matrycę z włókien węglowodanowych , które otaczają komórki, zakotwiczając je w miejscu. Uważa się, że agaroza jest osmotycznie , dlatego roztwory mogą przenikać przez żel i oddziaływać na komórki bez zmiany pozycji komórek.

W badaniu in vitro komórki byłyby wystawiane na działanie czynnika testowego – zwykle światła UV , promieniowania jonizującego lub genotoksycznej substancji chemicznej – w celu wywołania uszkodzenia DNA w zamkniętych komórkach. Do kalibracji zwykle stosuje się nadtlenek wodoru , aby zapewnić znormalizowany poziom uszkodzeń DNA.

Liza

Szkiełka są następnie zanurzane w roztworze, który powoduje lizę komórek . Roztwór do lizy często używany w teście kometowym składa się z silnie stężonej soli wodnej (często można użyć zwykłej soli kuchennej ) i detergentu (takiego jak Triton X-100 lub sarkozynian ). pH roztworu do lizy można regulować (zwykle między pH obojętnym a zasadowym ) w zależności od rodzaju uszkodzenia, które bada badacz .

Wodna sól zakłóca białka i ich wzorce wiązań w komórce, jak również zakłóca zawartość RNA w komórce. Detergent rozpuszcza błony komórkowe . W wyniku działania roztworu do lizy komórki ulegają zniszczeniu. Wszystkie białka, RNA, błony oraz cytoplazmatyczne i nukleoplazmatyczne są rozrywane i dyfundują do matrycy agarozowej. Pozostaje tylko DNA komórki, które rozwija się, aby wypełnić wnękę w agarozie, którą wcześniej wypełniała cała komórka. Ta struktura nazywana jest nukleoidem (ogólny termin określający strukturę, w której skoncentrowane jest DNA).

Elektroforeza

Po lizie komórek (zwykle 1 do 2 godzin w temperaturze 4°C) szkiełka przemywa się wodą destylowaną w celu usunięcia wszystkich soli i zanurza w drugim roztworze – roztworze do elektroforezy . Ponownie, pH tego roztworu można dostosować w zależności od rodzaju badanego uszkodzenia.

Szkiełka pozostawia się na około 20 minut w roztworze do elektroforezy przed przyłożeniem pola elektrycznego . W warunkach alkalicznych podwójna helisa DNA ulega denaturacji , a nukleoid staje się jednoniciowy.

Przykłada się pole elektryczne (zwykle 1 V / cm ) przez ~20 minut. Szkiełka są następnie neutralizowane do pH 7, barwione barwnikiem fluorescencyjnym specyficznym dla DNA i analizowane za pomocą mikroskopu z dołączonym CCD ( urządzenie ze sprzężeniem ładunkowym – zasadniczo aparat cyfrowy ), który jest podłączony do komputera z oprogramowaniem do analizy obrazu .

Tło

Koncepcja leżąca u podstaw testu SCGE polega na tym, że nieuszkodzone DNA zachowuje wysoce zorganizowany związek z białkami macierzy w jądrze. Kiedy jest uszkodzona, ta organizacja zostaje zakłócona. Poszczególne nici DNA tracą swoją zwartą strukturę i rozluźniają się, rozszerzając się z wnęki do agarozy. Po przyłożeniu pola elektrycznego DNA, które ma całkowity ładunek ujemny, jest przyciągane w kierunku dodatnio naładowanej anody. Nieuszkodzone nici DNA są zbyt duże i nie opuszczają jamy, natomiast im mniejsze fragmenty, tym dalej mogą się swobodnie przemieszczać w określonym czasie. Dlatego ilość DNA, która opuszcza jamę, jest miarą ilości uszkodzeń DNA w komórce.

Analiza obrazu mierzy ogólną intensywność fluorescencji dla całego nukleoidu i fluorescencji migrującego DNA i porównuje te dwa sygnały. Im silniejszy sygnał z migrującego DNA, tym więcej uszkodzeń. Ogólna struktura przypomina kometę (stąd „test kometowy”) z okrągłą głową odpowiadającą nieuszkodzonemu DNA, które pozostaje w jamie, oraz ogonem uszkodzonego DNA. Im jaśniejszy i dłuższy ogon, tym wyższy poziom obrażeń.

Test kometowy jest wszechstronną techniką wykrywania uszkodzeń, a po dostosowaniu protokołu może być stosowany do ilościowego określania obecności szerokiej gamy zmian chorobowych (uszkodzeń) DNA. Zwykle wykrywane uszkodzenia to pęknięcia pojedynczej nici i podwójne pęknięcia nici. Czasami mówi się, że alkaliczne i całkowita denaturacja DNA są niezbędne do wykrycia pęknięć pojedynczej nici. Jednak nie jest to prawdą, zarówno pojedyncze, jak i podwójne pęknięcia nici są wykrywane również w warunkach neutralnych. Jednak w warunkach alkalicznych wykrywane są dodatkowe struktury DNA jako uszkodzenia DNA: miejsca AP (miejsca bezzasadowe, w których brakuje nukleotydu pirymidynowego lub purynowego ) oraz miejsca, w których zachodzi naprawa przez wycięcie .

Test kometowy jest niezwykle czułym testem uszkodzeń DNA. Z tą wrażliwością należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ jest ona również podatna na zmiany fizyczne, które mogą wpływać na powtarzalność wyników. Zasadniczo należy unikać wszystkiego, co może spowodować uszkodzenie DNA lub denaturację, z wyjątkiem badanego czynnika (czynników). Najbardziej powszechną formą testu jest wersja alkaliczna, chociaż nie ma jeszcze ostatecznego protokołu testu alkalicznego. Dzięki prostej i niedrogiej konfiguracji może być stosowany w warunkach, w których bardziej złożone testy nie są dostępne.

Aplikacje

Obejmują one testy genotoksyczności, biomonitoring człowieka i epidemiologię molekularną, ekogenotoksykologię, a także podstawowe badania nad uszkodzeniami i naprawą DNA. Na przykład Swain i Rao, używając testu kometowego, zgłosili znaczny wzrost kilku rodzajów uszkodzeń DNA w neuronach mózgu szczura i astrocytach podczas starzenia , w tym pęknięć pojedynczej nici, pęknięć podwójnej nici i zmodyfikowanych zasad (8-OHdG i uracyl).

Fragmentacja DNA plemników

Test kometowy może określić stopień fragmentacji DNA w plemnikach. Stopień fragmentacji DNA został powiązany z wynikami zapłodnienia in vitro .

Kometa została zmodyfikowana do użytku z plemnikami jako narzędzie do diagnostyki męskiej niepłodności

Aby rozbić te ściśle związane białka protaminowe w celu wykorzystania komety jako plemników, wymagane są dodatkowe kroki w protokole dekondensacji.

  1. ^    Singh, Narendra P.; McCoy, Michael T.; Tice, Raymond R.; Schneider, Edward L. (1988-03-01). „Prosta technika ilościowego oznaczania niskich poziomów uszkodzeń DNA w poszczególnych komórkach” . Eksperymentalne badania komórkowe . 175 (1): 184–191. doi : 10.1016/0014-4827(88)90265-0 . ISSN 0014-4827 . PMID 3345800 .
  2. ^   Tice, RR (2000). „Single Cell Gel / Comet Test: Wytyczne dotyczące badań toksykologii genetycznej in vitro i in vivo” . Mutageneza środowiskowa i molekularna . 35 (3): 206–21. doi : 10.1002/(SICI)1098-2280(2000)35:3<206::AID-EM8>3.0.CO;2-J . PMID 10737956 .
  3. Bibliografia    _ Parasuraman, S; Shanmugam, MM; Rao, KR; Chand, P; Bhat, BV (2011). „Ocena uszkodzeń DNA za pomocą elektroforezy w żelu jednokomórkowym (test kometowy)” . J Pharmacol Pharmacother . 2 (2): 107–11. doi : 10.4103/0976-500X.81903 . PMC 3127337 . PMID 21772771 .
  4. ^    Collins, AR (marzec 2004). „Test kometowy do uszkodzenia i naprawy DNA: zasady, zastosowania i ograniczenia” . Mol. Biotechnologia . 26 (3): 249–61. doi : 10.1385/MB:26:3:249 . PMID 15004294 . S2CID 34355649 .
  5. Bibliografia    _ Parasuraman, S; Shanmugam, MM; Rao, KR; Chand, P; Bhat, BV (kwiecień 2011). „Ocena uszkodzeń DNA za pomocą elektroforezy w żelu jednokomórkowym (test kometowy)” . J Pharmacol Pharmacother . 2 (2): 107–11. doi : 10.4103/0976-500X.81903 . PMC 3127337 . PMID 21772771 .
  6. Bibliografia      _ Wang, Zemin; Klaunig, James E. (2015-08-06). „Alkaliczny test kometowy do oceny uszkodzeń DNA w poszczególnych komórkach”. Aktualne protokoły w toksykologii . 65 : 3.12.1–11. doi : 10.1002/0471140856.tx0312s65 . ISBN 978-0471140856 . ISSN 1934-9262 . PMID 26250399 . S2CID 6105193 .
  7. ^    Møller, Peter (kwiecień 2006). „Alkaliczny test kometowy: w kierunku walidacji w biomonitorowaniu narażenia na uszkodzenie DNA” . Farmakologia podstawowa i kliniczna oraz toksykologia . 98 (4): 336–345. doi : 10.1111/j.1742-7843.2006.pto_167.x . ISSN 1742-7835 . PMID 16623855 .
  8. ^    Belyaev, Igor Y; Eriksson, Stefan; Nygren, Jonas; Torudd, Jesper; Harms-Ringdahl, Mats (1999-08-05). „Wpływ bromku etydyny na organizację pętli DNA w ludzkich limfocytach mierzony za pomocą anomalnej zależności lepkości od czasu i elektroforezy żelowej pojedynczych komórek”. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Przedmioty ogólne . 1428 (2–3): 348–356. doi : 10.1016/S0304-4165(99)00076-8 . ISSN 0304-4165 . PMID 10434054 .
  9. ^     Oliwka, PL; Banáth, JP; Durand, RE (kwiecień 1990). „Heterogeniczność uszkodzenia i naprawy DNA wywołanego promieniowaniem w komórkach nowotworowych i normalnych mierzona za pomocą testu„ komety ””. Badania promieniowania . 122 (1): 86–94. Bibcode : 1990RadR..122...86O . doi : 10.2307/3577587 . ISSN 0033-7587 . JSTOR 3577587 . PMID 2320728 .
  10. Bibliografia    _ McMillan, TJ (1990-10-01). „Uszkodzenie i naprawa DNA po leczeniu promieniowaniem jonizującym” . Radioterapii i Onkologii . 19 (2): 95–108. doi : 10.1016/0167-8140(90)90123-E . ISSN 0167-8140 . PMID 2255771 .
  11. ^    Wojewódzka, Maria; Buraczewska, Iwona; Kruszewski, Marcin (2002-06-27). „Zmodyfikowany neutralny test kometowy: eliminacja lizy w wysokiej temperaturze i walidacja testu z przeciwciałem przeciwko jednoniciowemu DNA”. Badania mutacji . 518 (1): 9–20. doi : 10.1016/s1383-5718(02)00070-0 . ISSN 0027-5107 . PMID 12063063 .
  12. ^    Collins, Andrew R (1997-04-29). „Test komet: co tak naprawdę może nam powiedzieć?”. Badania mutacji / podstawowe i molekularne mechanizmy mutagenezy . 375 (2): 183–193. doi : 10.1016/S0027-5107(97)00013-4 . ISSN 0027-5107 . PMID 9202728 .
  13. Bibliografia    _ Ewen, SW; Collins, AR (wrzesień 1992). „Jednokomórkowa elektroforeza żelowa zastosowana do analizy uszkodzeń UV-C i ich naprawy w komórkach ludzkich”. Międzynarodowy Dziennik Biologii Radiacyjnej . 62 (3): 313–320. doi : 10.1080/09553009214552161 . ISSN 0955-3002 . PMID 1356133 .
  14. ^ Teoretyczne i praktyczne ograniczenia testu omówiono np. w Klaude i in. (1996) oraz Collins i in. (1997).
  15. ^ https://www2.le.ac.uk/departments/csmm/.../SCG%20Electrophoresis.pdf [ stały martwy link ]
  16. Bibliografia _ Subba Rao, K (sierpień 2011). „Badanie uszkodzeń DNA za pomocą testu kometowego i działań naprawczych polegających na wycinaniu zasad w neuronach mózgu szczura i astrocytach podczas starzenia”. Twórca starzenia się mechów 132 (8–9): 374–81. doi:10.1016/j.mad.2011.04.012. PMID 21600238. S2CID 22466782
  17. ^   Simon L, Brunborg G, Stevenson M, Lutton D, McManus J, Lewis SE (maj 2010). „Znaczenie kliniczne uszkodzenia DNA plemników w wyniku wspomaganego rozrodu” . Hum Reprod . 25 (7): 1594–1608. doi : 10.1093/humrep/deq103 . PMID 20447937 .
  18. Bibliografia    _ Ganguly, Anutosh; Goswami, Usha (2006). „Uszkodzenie DNA w męskich komórkach gonad omułka zielonego (Perna viridis) po ekspozycji na wyroby tytoniowe”. Ekotoksykologia . 15 (4): 365–369. doi : 10.1007/s10646-006-0077-1 . PMID 16673160 . S2CID 13956778 .
  19. ^ Hughes CM, Lewis SEM, McKelvey-Martin V, Thompson W. Odtwarzalność pomiarów DNA plemników ludzkich przy użyciu testu elektroforezy żelowej z pojedynczą komórką. Mutation Research 1997 374:261-268.
  20. ^ ab Donnelly   , ET; McClure, N; Lewisa, SEM (1999). „Wpływ suplementacji askorbinianem i @-tokoferolem in vitro na integralność DNA i uszkodzenia DNA wywołane nadtlenkiem wodoru w ludzkich plemnikach” . Mutageneza . 14 (5): 505–511. doi : 10.1093/mutage/14.5.505 . PMID 10473655 .
  21. ^ Ribas-Maynou Jordi, Agustı'n Garcı'a-Peiro', Alba Fernandez-Encinas, Maria Jose' Amengual i Benet Jordi, dwuniciowe pęknięcia DNA plemników, mierzone testem kometowym, są związane z niewyjaśnionymi nawracającymi poronieniami u par bez Czynnik kobiecy

Dalsza lektura

Pobrano z „ https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Comet_assay&oldid=1110496647 ”