Zygosaccharomyces bailii
|
|
| Zygosaccharomyces bailii Komórki | |
|---|---|
| Zygosaccharomyces bailii w podłożu Sabourauda (100x) | |
| Klasyfikacja naukowa | |
| Królestwo: | Grzyby |
| Dział: | Ascomycota |
| Klasa: | drożdżaki |
| Zamówienie: | drożdżaki |
| Rodzina: | Saccharomycetaceae |
| Rodzaj: | Zygosaccharomyces |
| Gatunek: |
Z. baili
|
| Nazwa dwumianowa | |
|
Zygosaccharomyces bailii Barnett i in., 1983
|
|
| Synonimy | |
|
|
|
Zygosaccharomyces bailii to gatunek z rodzaju Zygosaccharomyces . Został początkowo opisany jako Saccharomyces bailii przez Lindnera w 1895 r., Ale w 1983 r. Został przeklasyfikowany jako Zygosaccharomyces bailii w pracy Barnetta i in.
Psucie wynikające z rozwoju drożdży Zygosaccharomyces jest szeroko rozpowszechnione, co powoduje znaczne straty ekonomiczne dla przemysłu spożywczego. W ramach tego rodzaju Z. bailii jest jednym z najbardziej uciążliwych gatunków ze względu na wyjątkową tolerancję na różne warunki stresowe. Szeroka gama produktów kwaśnych i/lub wysokocukrowych takich jak koncentraty owocowe, wina , napoje bezalkoholowe , syropy , keczup , majonez , pikle, dressingi do sałatek itp. są zwykle uważane za trwałe w przechowywaniu, tj. łatwo inaktywują szeroki zakres mikroorganizmów przenoszonych przez żywność. Jednak produkty te są nadal podatne na psucie się przez Z. bailii .
Morfologia i sposoby rozmnażania
Zygosaccharomyces bailii są zwykle elipsoidalne, nieruchome i rozmnażają się bezpłciowo przez wielostronne pączkowanie, tj. pąki mogą powstawać z różnych miejsc na komórkach. Podczas procesu pączkowania komórka rodzicielska wytwarza pączek na swojej zewnętrznej powierzchni. W miarę wydłużania się pąka jądro komórki macierzystej dzieli się i jedno jądro migruje do pąka. Materiał ściany komórkowej jest wypełniony w szczelinie między pączkiem a komórką macierzystą; ostatecznie pączek jest rozdzielany, tworząc komórkę potomną o nierównej wielkości. Z. baili wielkość komórek zmienia się w zakresie (3,5 - 6,5) x (4,5 - 11,5) μm, a komórki występują pojedynczo lub w parach, rzadko w krótkich łańcuchach. Zaobserwowano, że czas podwojenia tych drożdży wynosi około 3 godzin w temperaturze 23°C w drożdżowym bulionie azotowym zawierającym 20% (wag./obj.) fruktozy (pH 4,0). W bardziej stresujących warunkach czas generacji ulega znacznemu wydłużeniu.
Poza trybem rozmnażania bezpłciowego, w pewnych warunkach (np. stres żywieniowy) Z. bailii wytwarza zarodniki płciowe (askospory) w worku zwanym woreczkiem (liczba mnoga: woreczek). Zwykle każdy workowiec zawiera od jednego do czterech askospor, które są na ogół gładkie, cienkościenne, kuliste lub elipsoidalne. Należy wspomnieć, że askospory są rzadko obserwowane, ponieważ ich powstawanie jest trudne i może zająć dużo czasu; poza tym wiele szczepów drożdży traci zdolność do wytwarzania zarodników askosporowych podczas powtarzanych podhodowli w laboratorium. Na różnych agarach odżywczych Z. bailii kolonie są gładkie, okrągłe, wypukłe, barwy białej do kremowej, o średnicy 2 – 3 mm po 3 – 7 dniach. Ponieważ właściwości morfologiczne Zygosaccharomyces są identyczne z innymi rodzajami drożdży, takimi jak Saccharomyces , Candida i Pichia , niemożliwe jest odróżnienie Zygosaccharomyces od innych drożdży lub poszczególnych gatunków w obrębie rodzaju na podstawie makroskopowych i mikroskopowych obserwacji morfologicznych. Dlatego identyfikacja drożdży do poziomu gatunku jest bardziej zależna od cech fizjologicznych i genetycznych niż od kryteriów morfologicznych.
Warunki kulturowe
Ogólnie rzecz biorąc, do hodowli i liczenia drożdży odpowiednie jest każde podłoże zawierające glukozę, np. podłoże Sabourauda, agar z ekstraktem słodowym (MEA), agar z tryptonem i glukozą z ekstraktem drożdżowym (TGY), agar drożdżowo-glukozowo-chloromfenikolowy (YGC). Do wykrywania drożdży kwasoodpornych, takich jak Z. bailii zalecane są pożywki zakwaszone, takie jak MEA lub TGY z dodatkiem 0,5% (v/v) kwasu octowego. Posiew z pożywką agarową jest często używany do liczenia drożdży, przy czym technika rozsiewania powierzchniowego jest lepsza niż metoda wylewania płytek, ponieważ ta pierwsza technika zapewnia lepszy odzysk komórek przy mniejszych błędach rozcieńczenia. Typowe warunki inkubacji to atmosfera tlenowa, temperatura 25°C przez okres 5 dni. Z. bailii można zastosować wyższą temperaturę inkubacji (30°C) i krótszy czas inkubacji (3 dni) , ponieważ drożdże rosną szybciej w tej podwyższonej temperaturze.
Właściwości fizjologiczne
Spośród gatunków powodujących psucie się Zygosaccharomyces , Z. bailii posiada najbardziej wyraźną i zróżnicowaną charakterystykę odporności, umożliwiającą mu przetrwanie i namnażanie się w bardzo stresujących warunkach. Wydaje się, że Z. bailii preferuje środowiska ekologiczne, charakteryzujące się wysokimi warunkami osmotycznymi. Najczęściej opisywanymi siedliskami przyrodniczymi są suszone lub fermentowane owoce, wydzieliny z drzew (w winnicach i sadach) oraz na różnych etapach rafinacji cukru i produkcji syropów. Poza tym rzadko spotyka się Z. bailii jako główny czynnik powodujący psucie się żywności nieprzetworzonej; zwykle drożdże nabierają znaczenia w produktach przetworzonych tylko wtedy, gdy konkurencja z bakteriami i pleśniami jest ograniczona przez wewnętrzne czynniki, takie jak pH , aktywność wody ( aw ), konserwanty itp.
Charakterystyka odporności
Wyjątkową cechą Z. bailii jest jego wyjątkowa odporność na słabo kwasowe środki konserwujące powszechnie stosowane w żywności i napojach, takie jak kwas octowy , mlekowy , propionowy , benzoesowy, sorbinowy i dwutlenek siarki . Ponadto podano, że drożdże są w stanie tolerować wysokie etanolu (≥ 15% (v/v)). Zakresy pH i aw dla wzrostu są szerokie, odpowiednio 2,0 - 7,0 i 0,80 - 0,99. Poza odpornością na konserwanty, inne cechy, które przyczyniają się do psucia się Z. bailii to: (i) jego zdolność do energicznej fermentacji cukrów heksozowych (np. jedna żywotna komórka na opakowanie dowolnej wielkości), (iii) umiarkowana osmotolerancja (w porównaniu z Zygosaccharomyces rouxii ). Dlatego żywność szczególnie narażona na psucie się przez te drożdże ma zazwyczaj niskie pH (od 2,5 do 5,0), niską aw i zawierać wystarczającą ilość cukrów ulegających fermentacji.
Ekstremalna kwasoodporność Z. bailii została opisana przez wielu autorów. Wielokrotnie obserwowano wzrost drożdży w alkoholach owocowych (pH 2,8 - 3,0, 40 - 45% (w/v) sacharoza ) konserwowanych 0,08% (w/v) kwasem benzoesowym oraz w napojach (pH 3.2) zawierające 0,06% (wag./obj.) kwasu sorbinowego, 0,07% (wag./obj.) kwasu benzoesowego lub 2% (wag./obj.) kwasu octowego. Warto zauważyć, że poszczególne komórki w dowolnej Z. bailii różnią się znacznie pod względem odporności na kwas sorbinowy, przy czym niewielka frakcja jest w stanie rosnąć na poziomie środków konserwujących dwukrotnie przekraczających średnią populację. W niektórych rodzajach żywności drożdże mogą rosnąć nawet w obecności kwasu benzoesowego i sorbinowego w stężeniach wyższych niż prawnie dozwolone i przy wartościach pH poniżej pK z kwasów. Na przykład, zgodnie z prawodawstwem Unii Europejskiej (UE), kwas sorbinowy jest ograniczony do 0,03% (w/v) w napojach bezalkoholowych (pH 2,5 - 3,2); jednakże Z. bailii może rosnąć w napojach bezalkoholowych zawierających 0,05% (wag./obj.) tego kwasu (pKa 4,8 ). W szczególności istnieją mocne dowody na to, że odporność Z. bailii jest stymulowany obecnością wielu konserwantów. W związku z tym drożdże mogą przetrwać i pokonać synergistyczne kombinacje środków konserwujących, które normalnie zapewniają stabilność mikrobiologiczną przetworzonej żywności. Zaobserwowano, że wychwyt kwasu octowego przez komórki był hamowany, gdy do pożywki hodowlanej wprowadzano kwas sorbinowy lub benzoesowy. Podobnie etanolu do 10% (v/v) nie wpływały niekorzystnie na odporność drożdży na kwas sorbinowy i benzoesowy przy pH 4,0 - 5,0. Co więcej, Sousa i in. (1996) udowodnili, że w Z. bailii , etanol pełni rolę ochronną przed negatywnym działaniem kwasu octowego poprzez hamowanie transportu i gromadzenia tego kwasu wewnątrzkomórkowo.
Podobnie jak inne mikroorganizmy, Z. bailii ma zdolność przystosowania się do subinhibicyjnych poziomów środka konserwującego, co umożliwia drożdżom przeżycie i wzrost w znacznie wyższych stężeniach środka konserwującego niż przed adaptacją. Ponadto wydaje się, że odporność Z. bailii na kwas octowy , benzoesowy i propionowy jest silnie skorelowana, ponieważ komórki, które zostały zaadaptowane do kwasu benzoesowego , wykazywały również zwiększoną tolerancję na inne konserwanty.
Niektóre badania wykazały pomijalny wpływ różnych cukrów na odporność Z. bailii na środki konserwujące , np. obserwowano porównywalną odporność na kwas sorbinowy i benzoesowy niezależnie od tego, czy komórki hodowano w pożywce hodowlanej zawierającej glukozę czy fruktozę jako substraty ulegające fermentacji. Jednak na odporność drożdży na środki konserwujące ma wpływ poziom glukozy, przy czym maksymalną odporność uzyskuje się przy stężeniu cukru 10-20% (wag./obj.). Jak Z.bailii jest umiarkowanie osmotolerancyjny, poziom soli i cukru w żywności jest zwykle niewystarczający do kontrolowania jego wzrostu. Najwyższą tolerancję na sól zaobserwowano przy niskich wartościach pH, np. maksymalne NaCl umożliwiające wzrost wynosiło 12,5% (wag./obj.) przy pH 3,0, podczas gdy wynosiło to tylko 5,0% (wag./obj.) przy pH 5,0. Ponadto obecność soli lub cukru ma pozytywny wpływ na zdolność Z. bailii do inicjowania wzrostu przy ekstremalnych poziomach pH, np. drożdże nie wykazywały wzrostu przy pH 2,0 pod nieobecność NaCl i sacharozy , ale rosły przy tym pH w 2,5% (wag./obj.) NaCl lub 50% (wag./obj.) sacharoza .
Większość fakultatywnie fermentujących gatunków drożdży nie może rosnąć przy całkowitym braku tlenu. Oznacza to, że ograniczenie dostępności tlenu może być przydatne w kontrolowaniu psucia się żywności spowodowanego przez drożdże fermentacyjne. Jednak zaobserwowano, że Z. bailii jest w stanie szybko rosnąć i energicznie fermentować cukier w złożonej pożywce w warunkach ściśle beztlenowych, co wskazuje, że wymagania żywieniowe dla wzrostu beztlenowego zostały spełnione przez złożone składniki pożywki. Dlatego ograniczenie dostępu tlenu do żywności i napojów bogatych w składniki odżywcze nie jest obiecującą strategią zapobiegania ryzyku psucia się przez te drożdże. Poza tym Leyva i in. (1999) o tym poinformowali Z. bailii mogą zachować zdolność do psucia się poprzez wytwarzanie znacznej ilości gazu nawet w warunkach bez wzrostu (tj. w obecności cukrów, ale przy braku źródła azotu).
Konserwatywne mechanizmy oporności
Sugerowano różne strategie wyjaśniania oporności Z. bailii na słabo kwasowe środki konserwujące, które obejmują: (i) degradację kwasów, (ii) zapobieganie przedostawaniu się lub usuwaniu kwasów z komórek, (iii) zmiana celu inhibitora lub naprawienia wyrządzonej szkody. W szczególności wewnętrzne mechanizmy odporności Z. bailii są niezwykle elastyczne i wytrzymałe. Na ich funkcjonalność i skuteczność nie mają wpływu warunki środowiskowe, takie jak niskie pH, niska zawartość substancji odżywczych lub ograniczone składniki odżywcze.
Od dawna wiadomo, że Z. bailii może utrzymywać gradient kwasu w poprzek błony komórkowej, co wskazuje na indukcję systemu, dzięki któremu komórki mogą redukować gromadzenie się kwasu wewnątrzkomórkowego. Według Wartha (1977), Z. bailii wykorzystuje indukowalną, aktywną pompę transportową do wydalania anionów kwasowych z komórek w celu przeciwdziałania toksycznemu działaniu kwasów. Ponieważ pompa potrzebuje energii do optymalnego działania, wysoki poziom cukru wzmacnia Z. bailii odporność na konserwanty. Niemniej jednak pogląd ten został zakwestionowany na podstawie obserwacji, że stężenie kwasu było dokładnie takie, jak przewidywano na podstawie wewnątrzkomórkowego, zewnątrzkomórkowego pH i pKa kwasu . Poza tym jest mało prawdopodobne, aby samo wytłaczanie aktywnego kwasu wystarczyło do uzyskania nierównego rozmieszczenia kwasu w błonie komórkowej. Zamiast tego Z. bailii mógł opracować znacznie skuteczniejsze sposoby zmiany błony komórkowej w celu ograniczenia dyfuzyjnego wnikania kwasów do komórek. To z kolei radykalnie zmniejszy potrzebę aktywnego wytłaczania protonów i anionów kwasowych, oszczędzając w ten sposób dużo energii. Rzeczywiście, Warth (1989) doniósł, że stopień wychwytu kwasu propionowego przez dyfuzję u Z. bailii jest znacznie niższy niż u innych drożdży wrażliwych na kwasy (np. Saccharomyces cerevisiae ). Dlatego można sobie wyobrazić, że Z. bailii wkłada więcej wysiłku w ograniczanie napływu kwasów w celu zwiększenia swojej kwasoodporności.
Innym mechanizmem Z. bailii do radzenia sobie z prowokacją kwasem jest to, że drożdże wykorzystują H + -trifosfatazę adenozynową błony komórkowej (H + -ATPaza) do wydalania protonów z komórek, zapobiegając w ten sposób zakwaszeniu wewnątrzkomórkowemu. Ponadto Cole i Keenan (1987) zasugerowali, że Z. bailii obejmuje zdolność do tolerowania przewlekłych wewnątrzkomórkowych spadków pH. Poza tym fakt, że drożdże są w stanie metabolizować konserwanty, może również przyczynić się do ich tolerancji na kwasy. Odnośnie odporności Z. bailii na SO 2 , zaproponowano, że komórki zmniejszają stężenie SO2 poprzez wytwarzanie zewnątrzkomórkowych związków wiążących siarczyny, takich jak aldehyd octowy.
Metabolizm
Fruktofilne zachowanie jest dobrze znane u Z. bailii . W przeciwieństwie do większości innych drożdży, Z. bailii metabolizuje fruktozę szybciej niż glukozę i rośnie znacznie szybciej w żywności zawierającej ≥ 1% (w/w) fruktozy. Ponadto zaobserwowano, że na fermentację alkoholową w warunkach tlenowych ( efekt Crabtree ) u Z. bailii ma wpływ źródło węgla, tj. etanol jest wytwarzany z większą szybkością iz większą wydajnością fruktozy niż glukozy. To dlatego, że w Z. bailii fruktoza jest transportowana przez specyficzny system o dużej pojemności, podczas gdy glukoza jest transportowana przez system o mniejszej pojemności, który jest częściowo inaktywowany przez fruktozę i również przyjmuje fruktozę jako substrat.
Powolna fermentacja sacharozy jest bezpośrednio związana z metabolizmem fruktozy. Według Pitta i Hockinga (1997), Z. bailii nie może rosnąć w żywności zawierającej sacharozę jako jedyne źródło węgla. Ponieważ hydroliza sacharozy do glukozy i fruktozy wymaga czasu (w warunkach niskiego pH), istnieje duże opóźnienie między wytwarzaniem a psuciem się produktów zanieczyszczonych tymi drożdżami, gdy sacharoza jest stosowana jako główny składnik węglowodanowy. Jest to zwykle poprzedzone opóźnieniem 2 – 4 tygodni, a widoczne pogorszenie jakości produktu ujawnia się dopiero po 2 – 3 miesiącach od wytworzenia. jako napoje bezalkoholowe.
Fermentacja cukrów (np. glukozy, fruktozy i sacharozy) jest kluczową reakcją metaboliczną większości drożdży (w tym Z. bailii ) hodowanych w fakultatywnych warunkach beztlenowych. Ponieważ cukry są powszechnymi składnikami żywności i napojów, fermentacja jest typową cechą procesu psucia się. Zasadniczo cukry te są przekształcane w etanol i CO2 , co powoduje, że produkty tracą słodycz i nabierają charakterystycznego alkoholowego aromatu wraz z gazowaniem. Poza tym w niewielkich ilościach powstaje wiele produktów wtórnych, takich jak kwasy organiczne, estry, aldehydy itp. Z. bailii słynie z silnej produkcji metabolitów wtórnych, np. kwasu octowego, octanu etylu i aldehydu octowego. W wystarczająco wysokich stężeniach substancje te mogą mieć dominujący wpływ na jakość sensoryczną produktów. Większą odporność Z. bailii na słabe kwasy niż S. cerevisiae można częściowo wytłumaczyć jej zdolnością do metabolizowania konserwantów. Wykazano, że Z. bailii jest w stanie zużywać kwas octowy w obecności cukrów ulegających fermentacji, podczas gdy wszystkie systemy pobierania i wykorzystywania octanu S. cerevisiae są represjonowane przez glukozę. Ponadto, Z. bailii może również utleniająco rozkładać sorbinian i benzoesan (i wykorzystywać te związki jako jedyne źródło węgla), podczas gdy S. cerevisiae nie ma takiej zdolności.
Działania psujące
Według Thomasa i Davenporta (1985) wczesne doniesienia o psuciu się majonezu i sosów sałatkowych przez Z. bailii pochodzą z początku XX wieku. Bardziej szczegółowe badania przeprowadzone w latach 40. i 50. XX wieku potwierdziły, że Z. bailii był głównym psuciem kiszonych ogórków, różnych marynowanych mieszanek warzywnych, zakwaszanych sosów itp. Mniej więcej w tym samym czasie sporadycznie pojawiały się przypadki psucia się fermentacji w syropach owocowych i napojach konserwowanych umiarkowanym benzoesem poziom kwasu (0,04 - 0,05% (wag./wag.)). Znowu Z.bailii został zidentyfikowany jako źródło zepsucia. W dzisiejszych czasach, pomimo znacznych ulepszeń w kontroli formulacji, sprzęcie do przetwarzania żywności i technologiach sanitarnych (np. automatyczne czyszczenie na miejscu), drożdże nadal stanowią duży problem w sosach, zakwaszanej żywności, marynowanych lub marynowanych warzywach, koncentratach owocowych i różnych niegazowanych napojach owocowych . Z. baili jest również dobrze rozpoznawany jako jeden z głównych spoilerów w winach ze względu na wysoką odporność na kombinacje etanolu i kwasów organicznych przy niskim pH. Co więcej, psucie się przez te drożdże rozszerza się na nowe kategorie żywności, takie jak gotowe musztardy, gazowane napoje bezalkoholowe o smaku owocowym zawierające cytrusy, koncentraty soków jabłkowych i winogronowych. Zdolność Z. bailii do psucia szerokiej gamy produktów spożywczych jest odzwierciedleniem jego wysokiej odporności na wiele czynników stresowych. W związku z tym został przez kilku autorów wpisany na listę najniebezpieczniejszych drożdży psujących.
Psucie się przez Z. bailii często występuje w kwaśnej żywności o przedłużonej trwałości, która opiera się na połączonym działaniu kwasowości (np. octu), soli i cukru w celu powstrzymania wzrostu drobnoustrojów. Zepsuta żywność zwykle wykazuje zmiany sensoryczne, które mogą być łatwo rozpoznane przez konsumentów, co prowadzi do znacznych strat ekonomicznych z powodu reklamacji konsumentów lub wycofywania produktu. Obserwowalne oznaki psucia się obejmują wyciek produktu z pojemników, zmianę koloru, wydzielanie nieprzyjemnego zapachu drożdży, oddzielanie się emulsji (w majonezach, dressingach), zmętnieniu, flokulacji lub tworzeniu się osadów (w winach, napojach) oraz widocznych koloniach lub powstawaniu brązowego filmu na powierzchni produktów. Specyficzny posmak, któremu przypisano Z. bailii jest spokrewniony z H 2 S. Ponadto smak zepsutej żywności można modyfikować przez wytwarzanie kwasu octowego i estrów owocowych. Donoszono, że wzrost Z. bailii powoduje również znaczne tworzenie się gazów i etanolu, powodując typowy alkoholowy smak. Nadmierna produkcja gazów jest bezpośrednią konsekwencją wysokiej fermentowalności tych drożdży, aw pokarmach bardziej stałych w produkcie mogą pojawiać się pęcherzyki gazu. W ekstremalnych warunkach ciśnienie wytwarzanego gazu wewnątrz szklanych słoików lub butelek może osiągnąć taki poziom, że może dojść do eksplozji, stwarzając dodatkowe zagrożenie zranienia potłuczonym szkłem. Należy wspomnieć, że ogólnie wykrywalne psucie się przez drożdże wymaga obecności dużej liczby komórek, około 5 - 6 log CFU/ml.
Oprócz psucia się żywności, jako bezpośrednia konsekwencja wzrostu, Z. bailii może modyfikować teksturę i skład produktu w taki sposób, że może on być łatwiej skolonizowany przez inne mikroorganizmy powodujące psucie. Na przykład, wykorzystując kwas octowy, drożdże mogą podnieść pH pikli na tyle, aby umożliwić wzrost bakterii mniej tolerujących kwas. Poza tym, podobnie jak w przypadku innych drożdży, stężenie cukrów fermentujących w produkcie wpływa na szybkość psucia się przez Z. bailii , np. drożdże rosną szybciej w obecności 10% (w/w) niż 1% (w/w) glukozy . W szczególności Z. bailii mogą rosnąć i powodować psucie się z bardzo małej liczby inokulantów, zaledwie jednej zdolnej do życia komórki w ≥ 10 litrach napojów. Oznacza to, że wykrycie małej liczby komórek drożdży w produkcie nie gwarantuje jego stabilności. Żaden program kontroli jakości sanitarnej lub mikrobiologicznej nie jest w stanie poradzić sobie z takim stopniem ryzyka. Dlatego jedyną alternatywą byłoby przeformułowanie żywności w celu zwiększenia stabilności i/lub zastosowanie parametrów obróbki termicznej o wysokiej śmiertelności.